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绿僵菌MA4菌株对椰心叶甲的防效及其表皮降解蛋白酶基因Pr1A的克隆表达和抗血清研究

宋妍

   外来入侵生物椰心叶甲(Brontispa longissima (Gestro))是亚太地区棕榈科植物的毁灭性害虫,近年传入我国海南省等地后对当地的椰子、槟榔等棕榈科植物的生长造成严重危害,并导致重大经济和生态损失。本文通过室内毒力测定的方法,筛选出一株对椰心叶甲具有高毒力的绿僵菌菌株MA4,对其做了ITS鉴定,并对其表皮降解蛋白酶基因Pr1A进行了克隆表达和抗血清研究,同时就筛选到的高毒力和低毒力菌株研究了在不同培养基上它们的蛋白酶产量与毒力间的关系。主要结果如下: (1)采用土壤分离法和僵虫分离法,获得21株不同来源的绿僵菌。通过对这21株绿僵菌采用2级筛选法进行室内毒力测定,最终确定MA4菌株对椰心叶甲的毒力相对是最高的,为防治椰心叶甲的优势种。 (2)对MA4菌株的ITS进行了克隆和测序,并将之与GenBank已登录的ITS序列进行比较,发现与金龟子绿僵菌小孢变种(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)有很高的同源性,达到94.2%,且测出全长为524bp,说明MA4菌株很有可能为金龟子绿僵菌小孢变种。 (3)用明胶和椰心叶甲虫尸粉两种液体培养基对高毒力菌株MA4和弱毒力菌株MA12的蛋白酶产酶水平进行分析。两菌株在虫尸粉液体培养基中蛋白酶的产量明显高于明胶液体培养基,且MA4菌株的产酶量高于MA12菌株。此外,用明胶-琼脂平板法对MA4和MA12两株菌株的蛋白酶产量进行了测定,两菌株的最适产蛋白酶的温度都在28℃。不管用明胶-琼脂平板法还是虫尸粉液体培养基,所测得的蛋白酶的产量水平均与其对椰心叶甲的毒力之间存在相对应的关系。 (4)Pr1A基因的基因产物Pr1A蛋白具有很强的分解昆虫体壁的功能,在对昆虫的致病力中起着重要的作用。采用RT-PCR的方法,从MA4扩增得到Pr1A基因全长,此基因全长为1242bp,经Blastn分析此基因序列与M. anisopliae的Pr1A基因(M73795)同源率为98%。以pET-22b(+)为基础载体,构建pET-Pr1A重组表达载体,在大肠杆菌(Escherichia. coli )BL 21(DE3)中进行表达。经SDS-PAGE分析,获得了约42kDa大小的重组目的蛋白,表达的目的蛋白最高可占表达总蛋白含量的63.2%。 (5)将表达的Pr1A重组蛋白切胶回收,研磨成粉后加入等体积的福氏不完全佐剂,乳化制备成抗原,免疫家兔四次后,采血收集抗血清。该抗血清的ELISA效价为1/1000,并且Western-blotting分析表明Pr1A重组蛋白能与抗血清发生良好的免疫反应,说明获得了Pr1A重组蛋白的抗体。 (6)用所获得的Pr1A重组蛋白的抗体进行了免疫斑点杂交实验,检测了上述实验的MA4菌株培养了2d的明胶和虫尸粉液体培养基的蛋白酶液中Pr1A蛋白的表达情况,两者均呈阳性反应,但显色深浅程度有所不同。……   
[关键词]:绿僵菌;椰心叶甲;防效;表皮降解蛋白酶基因Pr1A;克隆表达;抗血清
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华南热带农业大学2007年