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嗜热毛壳菌热稳定超氧化物歧化酶的纯化及基因克隆和表达

郭芳先

   超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,简称SOD)(EC.1.15.1.1)系一类金属酶,广泛存在于生物体中。它能够催化超氧阴离子(O2.-)发生歧化反应,从而清除超氧阴离子。在生物体防御氧化损伤的过程中,发挥着重要作用。根据酶分子中所含金属辅基的不同,超氧化物歧化酶主要可分为CuZn-SOD(存在于真核生物中),Mn-SOD(存在于原核生物和真核生物中),Fe-SOD(存在于原核生物和高等植物的叶绿体中)等类型。Mn-SOD和Fe-SOD的氨基酸组成相似,可能起源于同一祖先。 嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)是一种广泛分布的,生长上限温度较高的嗜热真菌,从该菌中已分离了多种嗜热酶,但未见超氧化物歧化酶的报道。本研究中C. thermophilum在含干酪素的合成培养基中生长产生超氧化物歧化酶,通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子层析、Phenyl-Sepharose疏水层析等步骤获得了凝胶电泳条带均一的超氧化物歧化酶。 分别用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)的方法和Sephacryl S-100凝胶过滤层析的方法,测定出本研究所获得的超氧化物歧化酶的分子量分别为23.5kDa和94.4kDa,证明在本研究中所得到的超氧化物歧化酶是一种由4个相同的亚基所构成的蛋白质。本研究所得到的超氧化物歧化酶的反应最适pH值为7.5,酶的反应最适温度为60℃。在pH值为7.5的条件下,该酶在50℃和60℃时保温1h是基本稳定的,在70℃时保温1h后,仍保留有60%的酶活性;在80℃时,酶的半衰期约为25min。 C. thermophilum超氧化物歧化酶(Mn-SOD) N-端10个氨基酸序列为KATLPDLKYD,与Aspergillus fumigatus和Paracoccidioides brasiliensis超氧化物歧化酶(Mn-SOD)的N-端氨基酸序列有较高的同源性。 根据超氧化物歧化酶的氨基酸保守序列设计兼并引物,克隆了C. thermophilum热稳定超氧化物歧化酶CuZn-SOD和Mn-SOD的基因,随后提取C. thermophilum的基因组DNA,克隆了CuZn-SOD DNA序列,该序列包含三个内含子区域。这三个基因在GenBank中的注册号分别为DQ493760、EF569987、DQ683184。 将超氧化物歧化酶的基因cz1与酵母表达载体pPIC9K用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切后体外连接构建了酵母分泌型表达载体pPIC9K/cz1,转化巴斯德毕赤酵母获得了转酵母工程菌GS-CZ-10,酶蛋白表达量为0.56mg/mL,同时对重组超氧化物歧化酶的性质进行了研究。……   
[关键词]:嗜热毛壳菌;热稳定超氧化物歧化酶;纯化;cDNA克隆;表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东农业大学2007年