手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

贵州3种马铃薯病毒的DAS-ELISA检测及分子鉴定

郑世玲

   马铃薯是一种重要的全球性的经济作物,马铃薯病毒病是影响马铃薯生产的重要因子,马铃薯病毒是引起马铃薯退化的根本原因。马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)、马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)是严重危害我国马铃薯产量的三种主要病毒。本研究从贵州省六县一市的马铃薯种植区,对不同马铃薯品种的3种马铃薯病毒的发生症状进行了调查,并对采集的202份相关样品进行了双抗体夹心酶联免疫吸附测定(Double Antibody Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay,DAS-ELISA)的检测技术的研究,从而建立了一套完整的酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测PVX、PVY和PLRV程序。 根据PVX、PVY和PLRV的外壳蛋白基因序列,分别设计合成了三对特异性引物。分别从DAS-ELISA检测的感染马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒和马铃薯卷叶病毒为阳性的马铃薯叶片为试材,对马铃薯Y病毒采取反转录聚合酶链式反应(Reverse Transcription-Polymerase chain reaction,RT-PCR)和免疫捕获反转录聚合酶链式反应(Immunocapture RT-PCR,IC-RT-PCR)方法对PVY进行了分子鉴定,测序得到两条PVY外壳蛋白(coat protein,CP)基因序列,长度为804 bp。通过和其它己知PVY分离物CP基因序列的同源性比较和氨基酸序列差异性分析,并建立了PVY CP核苷酸序列的系统发育树及其类型的分析,序列已经登录了NCBI(GenBank登录号分别为EF063710与EF063712)。用IC-RT-PCR方法对PVX、PLRV进行了分子鉴定,测序得到两条PVX CP与PLRV CP基因序列,长度分别为714 bp和627bp,通过和其它已知分离物CP基因序列的同源性比较和氨基酸序列差异性分析,并建立了PVX CP、PLRV CP核苷酸序列的系统发育树及其类型的分析,序列己经登录了National Center for Biotechnology Information(NCBI),获得GenBank登录号分别为EF063709与EF063711。 本文报道了三种简捷、快速、灵敏、可靠的马铃薯病毒的检测技术:ELISA、RT-PCR和IC-RT-PCR检测技术。ELISA可在不需提纯病毒RNA的情况下实现对病毒的检测,较RT-PCR检测技术快速、简捷,更适合于大量样品的检测。IC-RT-PCR检测技术与RT-PCR检测技术相比省去了病毒RNA的提取这一烦琐步骤,操作更简单,灵敏度与RT-PCR基本相同,而RT-PCR与IC-RT-PCR检测技术较ELISA检测技术特异性更强。……