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绿豆癀护肝解毒作用及其机制研究

林文泉

   一、研究目的及意义: 绿豆癀是绿豆的加工制品,主产于台湾中南部山区,在台湾全岛被广为使用,认为功同绿豆,效果比绿豆更佳。本研究对台湾民间常用绿豆癀的加工方法、功效主治和使用经验进行系统整理,为规范其运用奠定基础;初步阐明绿豆癀的护肝、解毒作用及其机制,阐明绿豆癀的营养成分及化学成分,揭示其护肝、解毒作用的物质基础及其机制,为绿豆的开发利用拓宽途径,为市场提供一作用机制、物质基础明确的保健食品提供科学依据。 二、研究方法: 1、药理试验研究 以下主要选用了五大试验来评估绿豆癀的解毒和降脂作用,并探讨其部分作用机制。其中绿豆癀用双蒸水配制成浓度分别为0.15g/ml、0.075g/ml、0.375g/ml的高、中、低三个剂量的溶液;绿豆粉用双蒸水配制成浓度2.0g/ml绿豆粉溶液。用以比较绿豆癀作用是否优于绿豆粉,以及绿豆癀不同于绿豆粉的作用。 (1)绿豆癀抗CCl_4肝损伤作用的实验研究 将60只小鼠随机分为6组:正常对照组、模型组、绿豆粉组和绿豆癀高、中、低剂量组,每组10只,雌雄各半。正常对照组和模型组每天用0.5ml饮用水灌胃;绿豆粉组每天用0.5ml绿豆粉溶液灌胃:绿豆癀高、中、低剂量3组每天各用相应浓度绿豆癀溶液分别给0.5ml灌胃。正常喂养,连续实验7d,待末次给药后1h,除正常对照组腹腔注射0.2ml生理盐水外,其余各组按10.0ml/kg体重的剂量(约0.2ml)腹腔注射0.125%CCL_4花生油溶液.然后禁食不禁水,20h后摘眼球取血处死,血液静置3h,待凝固后分离血清,3000rpm离心10min,取上清液注入EP管,-20℃保存,按试剂盒说明书,用分光光度计分别测定AST及ALT;取部分肝右叶,用10%甲醛固定,常规石蜡包埋,切片,HE染色,光镜观察肝组织形态学变化。 (2)绿豆癀抗酒精性肝损伤作用的实验研究 将60只小鼠随机分为6组:正常对照组、模型组、绿豆粉组、绿豆癀高、中、低剂量组,每组10只,雌雄各半。正常对照组和模型组每天用0.5ml饮用水灌胃;绿豆粉组每天用0.5ml绿豆粉溶液灌胃,绿豆癀高、中、低剂量3个组每天各用相应浓度绿豆癀溶液分别给0.5ml灌胃,每日1次,共12次,正常喂养。最后一次灌胃后13h,除正常对照组灌胃0.3ml饮用水外,其余各组均灌胃0.3ml的50%乙醇造模。小鼠在造模后禁食不禁水,10h后脱臼处死小鼠,迅速取出肝脏,用冷生理盐水沖洗,滤纸吸干,称取0.3g,加入预冷生理盐水3ml,制备成10%的匀浆液,4500 rpm离心10min,取上清液注入试管,-20℃保存。按照试剂盒说明书的方法测定肝组织内GSH、MDA、TG含量;另取部分肝右叶,用10%甲醛固定,常规石蜡包埋,切片,HE染色,光镜观察肝组织形态学变化。 (3)绿豆癀调节血脂作用的实验研究 参照文献方法,用1%胆固醇,0.12%甲基硫氧嘧啶,0.13%胆盐,7.75%猪油,10%蛋黄粉,81%基础饲料制成高脂饲料;绿豆粉和绿豆癀均加工成颗粒饲料。将60只Wistar大鼠随机分为6组:正常对照组,模型组,绿豆粉组,绿豆癀高、中、低剂量组,每组10只,雌雄各半。绿豆粉组和绿豆癀高、中、低剂量组大鼠每只一个笼子单独喂养。大鼠食量按25g/天/只计算,正常对照组喂普通饲料;模型组大鼠每只每天喂高脂饲料17.5g+普通饲料7.5g;绿豆粉组大鼠每只每天喂高脂饲料17.5g+5g绿豆粉+普通饲料2.5g;绿豆癀低剂量组大鼠每只每天喂高脂饲料17.5g+绿豆癀2.5g+普通饲料5g;绿豆癀中剂量组大鼠每只每天喂高脂饲料17.5g+绿豆癀5g+普通饲料2.5g;绿豆癀高剂量组大鼠每只每天喂高脂饲料17.5g+绿豆癀7.5g。连续40天。末次喂饲后,禁食12h,腹主动脉取血,血液静置3h,待凝固后分离血清,3000rpm离心10min,取上清液注入EP管,-20℃保存,按试剂盒说明书,用分光光度计分别测定TG、LDL-C、HDL-C值。 (4)绿豆癀对肝GSH、GST影响的实验研究 待动物适应环境1周后,将60只动物按体重随机分为6个组:空白对照组,泼尼松龙组,绿豆粉组和绿豆癀高、中、低剂量组,每组10只,雌雄各半。空白对照组和泼尼松龙组每天用0.5ml饮用水灌胃;绿豆粉组每天用0.5ml绿豆粉液灌胃;绿豆癀高、中、低剂量3组每天用相应浓度绿豆癀液0.5ml灌胃。正常喂养,连续15d,除空白对照组外,其余各组从灌胃第8天开始每天皮下注射泼尼松龙(PSL)15mg/kg,连续5d。小鼠在末次给药后,摘眼球取血处死,离心分离血清,取肝脏用Tris-HCl 50 mmol/L(pH 7.4)制成25%肝匀浆,差速离心法制备微粒体及线粒体,-30℃保存。谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量按Ellman法测定,谷胧甘肽还原酶(gutathionereductase,GSH-Re)活性依文献及试剂盒规定方法测定。 (5)绿豆癀对肝CYP同功酶影响的实验研究 将动物按体重随机分为5个组:空白对照组、绿豆粉组和绿豆癀高、中、低剂量组,每组10只,雌雄各半。空白对照组每天用0.5ml生理盐水灌胃;绿豆粉组每天用0.5ml绿豆粉液灌胃;绿豆癀高、中、低剂量3组每天各用相应浓度绿豆癀液0.5ml灌胃。正常喂养,连续10d。10天后断头处死,取肝脏,按照钙沉淀法制备微粒体。肝微粒体制备:将肝组织制备成20%的匀浆,按每克肝组织加4m10.25mol/L蔗糖溶液或pH7.5TMS缓冲液(Tris,HCl、MgCl_2)及蔗糖,磨成匀浆。将组织匀浆置低温高速离心,12000g,30分钟,以沉淀未破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体。所得上清液即线粒体后上清液,小心倒出上清液,备用。取适量线粒体后上清液加CaCl_2液(终浓度8mmol/L),稍搅拌混合,放冰浴5分钟,高速离心机27000×g离心15分钟。用Lowry比色法测定肝微粒体的蛋白含量,用牛血清蛋白质做标准曲线,光谱测定P450含量,消光系数为105mmol(L.cm),按照文献方法测定细胞色素P450(CYP)含量、7-乙氧异恶唑-O-脱乙基酶(EROD)、苯胺羟化酶(ANH)、红霉素N-脱甲基酶(ERD)的活性。 2、药学试验研究 (1)绿豆癀中蛋白质的测定;2)绿豆癀中氨基酸的测定;(3)绿豆癀中不溶性膳食纤维的测定;(4)绿豆癀中核黄素的测定;(5)绿豆癀中胡萝卜素的测定;(6)绿豆癀中硫胺素的测定;(7)绿豆癀中烟酸的测定 三、研究结果 1、药理试验结果 ()绿豆癀抗CCl_4肝损伤作用的实验结果 AST、ALT:与正常对照组相比,模型组小鼠血清AST、ALT含量均明显升高(P<0.01),表明CCl_4肝损伤造模成功。绿豆癀低、中剂量能抑制小鼠血清AST的升高(P<0.05),绿豆粉和绿豆癀高剂量均能抑制小鼠血清AST升高,但与模型组相比无统计学意义;绿豆粉和不同剂量的绿豆癀均能抑制小鼠血清ALT的升高(P<0.01或P<0.05);而绿豆癀低剂量组比绿豆粉组有更好的效果(P<0.05)。 肝组织病理:与正常对照组相比,模型组小鼠肝细胞气球样变、脂肪变性、胞浆凝聚、肝细胞坏死均多于正常对照组,尤其是后者,模型组与正常对照组有明显差异(P<0.01),绿豆癀高剂量组的肝细胞坏死程度比模型组轻,两者有显著差别(P<0.05)。但各治疗组小鼠肝细胞气球样变、脂肪变性、胞浆凝聚、肝细胞坏死与模型组相比无统计学意义。 (2)绿豆癀抗酒精性肝损伤作用的实验结果 TG、MDA、GSH:与正常对照组相比,模型组TG、MDA均明显升高,GSH明显降低(P<0.01或P<0.05),表明成功复制出小鼠酒精肝损伤模型。绿豆粉和绿豆癀各剂量均能降低MDA,但与模型组相比无统计学意义;绿豆粉和绿豆癀各剂量均能升高GSH,但只有绿豆粉和绿豆癀低剂量组与模型组相比,有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。绿豆粉和绿豆癀各剂量均能降低TG,但只有绿豆粉和绿豆癀中剂量组与模型组相比,有统计学意义(P<0.01)。 肝组织病理:与正常对照组相比,模型组小鼠肝细胞脂肪变性明显多于正常对照组(P<0.01)。各治疗组小鼠肝细胞脂肪变性与模型组相比明显减少(P<0.01)。 (3)绿豆癀调节血脂作用的实验结果 TG、LDL-C、HDL-C:与正常对照组相比,模型组TG、LDL-C均明显升高,HDL-C明显降低(P<0.01),表明成功复制出大鼠高脂血症模型。绿豆粉和绿豆癀低、中剂量虽能降低LDL-C,但与模型组相比,无统计学意义,绿豆癀高剂量能明显降低LDL-C(P<0.01),而且其效果明显比绿豆粉组高(P<0.05);绿豆粉和绿豆癀各剂量均能明显降低TG、升高HDL-C(P<0.01或P<0.05),绿豆癀中、高剂量的效果更佳,与绿豆粉相比有明显差异(P<0.01)。 (4)绿豆癀对肝GSH、GST影响的实验结果 泼尼松龙组GSH比空白对照组明显降低(p<0.01)。绿豆粉组和绿豆癀三组GSH降低均比泼尼松龙组小(p<0.05或p<0.01)。绿豆癀组尤以高剂量下降最小,中剂量次之,高剂量与绿豆粉比较有明显差异(p<0.01)。绿豆癀的高剂量组可以提高GSH—Re的活性。 (5)绿豆癀对肝CYP同功酶影响的实验结果 绿豆粉和绿豆癀3组均可使小鼠肝线粒体CYP含量明显升高(p<0.01),尤以绿豆癀高剂量组作用最强,其与绿豆粉组相比,亦有明显差异(p<0.05)。从表8可以看出,绿豆癀中、高两组CYP同功酶EROD和ANH的活性明显下降,而ERD的活性明显升高(p<0.01或p<0.05),尤以高剂量组作用更强。 2、绿豆癀化学及营养成分测定的实验结果 绿豆癀中蛋白质含量略低于绿豆粉,但无显著的统计学差异;绿豆癀中氨基酸含量、不溶性膳食纤维、核黄素、胡萝卜素、硫胺素和烟酸含量均高于绿豆粉组。 四、结论 提示绿豆癀有较好的护肝解毒作用和较明显的降血脂作用。其作用机制除了一般的抗氧化作用外,还可能与调节CYP酶系中不同酶的活性有关。在实验中,还设立了绿豆粉组作对照。在各实验组中,绿豆粉与绿豆癀有相似的作用,但总的看来,作用比绿豆癀低。在本研究中,还对绿豆癀的多项化学及营养成分进行了测定。结果是绿豆癀中所含多项氨基酸、不溶性膳食纤维、核黄素、胡萝卜素、硫胺素及烟酸等各类化学及营养成分较绿豆粉明显为高。 本研究的创新点是:(1)对台湾民间常用的绿豆癀的加工方法、功效主治和使用经验进行了较系统整理;(2)通过多种动物模型和多项指标(尤其是肝药酶指标)探讨了绿豆癀的护肝、解毒的药理作用及其机制;(3)初步阐明绿豆癀的营养成分及化学成分,揭示其护肝、解毒作用的部分物质基础。……   
[关键词]:绿豆癀;绿豆;护肝;解毒;作用机制
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:广州中医药大学2007年