手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素生物学功能研究

孙延鸣

   捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)属毛圆科(Trichostrongylidae)血矛属(Haemonchus)线虫,分布较广,寄生于反刍动物第四胃和小肠,因吸血可导致贫血和衰弱,引起幼龄动物,尤其是羔羊死亡,对畜牧业造成极大经济损失。 凝集素是自然界广泛存在的一大类非免疫来源的、无酶活性的糖类结合蛋白,能促使细胞发生凝集。其生物学作用涉及到许多重要的生理和病理活动,如受精、发育、细胞增殖、分化,内环境稳定、免疫应答、感染、炎症、癌细胞转移及与血栓形成有关的心脑血管疾病等等。半乳糖结合凝集素是其中的一类,也具有广泛的功能,参与细胞粘附、凋亡及免疫反应等多种生物学过程。 凝集素在植物中的研究已有一百多年的历史,但在线虫中的研究相对较晚,尤其是捻转血矛线虫半乳糖结合凝集素(galectin)的研究只有十几年的时间。1994年,Smith从捻转血矛线虫肠道粘膜分离到一种糖蛋白复合物——H-gal-GP,用其免疫羔羊然后攻虫,发现虫卵排出减少>90%,成虫减少>70%,是一种很好的疫苗候选抗原。此后,捻转血矛线虫的galectin基因不断被克隆和鉴定,作为疫苗的候选抗原也逐渐受到关注。此前,我们实验室分别从雌性、雄性捻转血矛线虫体内克隆到了Hco-gal-f(Acc.no.AY253331)和Hco-gal-m(Acc.no.AY253330)两个完整的galectins编码序列,并分别表达了它们。在此研究基础上,我们进行了以下工作: 1.捻转血矛线虫重组galectins对山羊外周血淋巴细胞细胞因子mRNA转录的抑制作用 以体外试验观察雌、雄性捻转血矛线虫重组半乳糖结合凝集素(rHco-gal-m/f)蛋白对山羊外周血淋巴细胞多种细胞因子mRNA转录水平的影响及其量效关系。选用2岁健康山羊5只,分别从颈静脉无菌采血,分离外周血淋巴细胞,以ConA或LPS刺激细胞的同时分别加入Oμg/ml、10μg/ml、20μg/ml和40μg/ml的rHco-gal-m/f进行体外培养。用RT-PCR方法,以β-actin作内标,定量分析淋巴细胞中白介素-1β(IL-1β)、白介素-2(IL-2)、白介素-4(IL-4)、白介素-6(IL-6)、干扰素-γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA丰度。结果显示,雄性捻转血矛线虫重组半乳糖结合凝集素(rHco-gal-m)可以抑制上述细胞因子mRNA的转录,并呈现出明显的剂量依赖性;雌性捻转血矛线虫重组半乳糖结合凝集素(rHco-gal-f)可抑制IL-1β、IL-4、IFN-γand TNF-αmRNA的转录,也呈现出明显的剂量依赖性。结果表明重组的捻转血矛线虫galectins能降低多种细胞因子在体外的转录。 2.捻转血矛线虫重组galectins诱导山羊淋巴细胞凋亡的作用 为了探讨雌、雄性捻转血矛线虫重组半乳糖结合凝集素(rHco-gal-m/f)诱导天然宿主山羊外周血淋巴细胞凋亡的作用,采用电镜观察、DNA琼脂糖凝胶电泳、流式细胞术等方法,检测了对淋巴细胞凋亡的影响。结果显示,电镜下可见大量的细胞核固缩、碎裂,染色体被染成深蓝色或蓝黑色,染色质边集,出现典型凋亡小体的凋亡细胞;DNA凝胶电泳可见典型的梯形条带;流式细胞术定量分析发现rHco-gal-m/f诱导山羊外周血淋巴细胞凋亡,并呈现明显的时间和剂量效应关系。 3.捻转血矛线虫重组galectins抗凝血作用 为了研究捻转血矛线虫重组galectins蛋白的抗凝血作用,应用试管法观察了该重组galectin蛋白对8只山羊凝血时间的影响。结果显示,雄、雌性捻转血矛线虫重组galectin蛋白均有相似的抗凝血活性,能显著延长山羊血液的凝血时间(P<0.01,P<0.01);随着蛋白浓度的增加,抗凝血作用也逐渐增强。说明捻转血矛线虫重组galectin蛋白具有一定的抗凝血作用,其机制有待于进一步研究。 4.捻转血矛线虫重组galectins的免疫保护性试验 使用雌、雄性捻转血矛线虫重组galectin蛋白,对9-10月龄山羊做了免疫保护性试验。健康山羊16只,随机分成4组,每组4只。第一组每次免疫10mgrHco-gal-m/f(5mg rHco-gal-m和5mg rHco-gal-f),第二组每次免疫5mgrHco-gal-m/f(2.5mg rHco-gal-m和2.5mg rHco-gal-f),同时设立不攻虫对照组和攻虫对照组。第一次免疫使用弗氏完全佐剂和重组抗原混合乳化,第二次免疫使用弗氏不完全佐剂和重组抗原混合乳化,在试验山羊的背部皮下多点注射免疫,两个对照组用1ml PBS代替重组抗原,共免疫两次,间隔2周。10mg免疫组,5mg免疫组和攻虫对照组山羊于第二次免疫14天后口腔接种5000条捻转血矛线虫第三期感染性幼虫。从攻虫后第22至34天,每隔一天采集粪便,虫卵计数。攻虫后35天,屠宰山羊,剖解皱胃,分离雌雄虫体,分别计数。结果显示,在试验结束时,10mg免疫组与攻虫对照组相比,山羊虫卵排出减少37.25%(P<0.05),荷虫数减少41.1%(P<0.05);5mg免疫组,山羊虫卵排出减少48.03%(P<0.01),荷虫数减少46.19%(P<0.01)。说明重组galectin蛋白对山羊捻转血矛线虫的感染有部分的免疫保护效果。 5.捻转血矛线虫重组galectins诱导的血清与局部抗体反应 使用雌、雄性捻转血矛线虫重组galectin蛋白,对9-10月龄山羊做免疫保护性试验的同时,使用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法,测定了所有试验山羊血清特异性免疫球蛋白IgG滴度、血清IgA浓度以及胃粘膜表面和胃粘膜组织匀浆中IgA浓度。结果显示,攻虫前,10mg和5mg免疫组山羊血清特异性rHco-gal-m/f抗体IgG滴度均极显著地高于不攻虫对照组(P<0.01)和攻虫对照组(P<0.01);两个免疫组的血清IgA水平有所升高。攻虫后,10mg和5mg免疫组血清特异性rHco-gal-m/f抗体IgG滴度极显著地高于不攻虫对照组(P<0.01)和攻虫对照组(P<0.01);10mg、5mg免疫组和攻虫对照组的血清IgA水平明显高于不攻虫对照组(P<0.05,P<0.05,P<0.05)。两个免疫组和攻虫对照组山羊的胃粘膜表面IgA浓度明显高于不攻虫对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。10mg和5mg免疫组山羊的胃粘膜组织匀浆IgA浓度显著高于攻虫对照组(P<0.05,P<0.05)。此外,10mg和5mg免疫组之间的血清特异性免疫球蛋白IgG滴度、血清IgA浓度以及胃粘膜表面和胃粘膜组织匀浆中IgA浓度差异均不显著。特异性rHco-gal-m/f抗体IgG水平与山羊捻转血矛线虫荷虫数之间呈显著的负相关性关系(r=-0.657,P<0.05);胃粘膜组织匀浆IgA浓度与山羊荷虫数之间呈显著的负相关性关系(r=-0.692;P<0.05)。说明特异性rHco-gal-m/f抗体IgG水平和胃粘膜组织匀浆中的IgA水平在抵抗捻转血矛线虫感染的过程中可能起到重要的作用。 6.捻转血矛线虫重组galectins诱导山羊的CD4~+、CD8~+T和B淋巴细胞免疫应答 为了探索山羊获得性免疫保护机理,使用雌、雄性捻转血矛线虫重组galectin蛋白免疫山羊后,利用流式细胞术,检测了所有试验山羊外周血中CD4~+、CD8~+T淋巴细胞和B淋巴细胞所占比例。结果显示,攻虫前,10mg免疫组CD4~+T淋巴细胞水平显著高于不攻虫对照组(P<0.01);10mg免疫组CD8~+T淋巴细胞水平显著高于不攻虫对照组(P<0.01);5mg和10mg免疫组的B淋巴细胞水平显著高于不攻虫对照组(P<0.05,P<0.05)。攻虫后,10mg、5mg免疫组和攻虫对照组CD4~+T淋巴细胞水平显著高于不攻虫对照组(P<0.05,P<0.05,P<0.05);攻虫对照组的CD8~+T淋巴细胞水平明显高于10mg免疫组(P<0.01);攻虫对照组的B淋巴细胞显著高于5mg和10mg免疫组(P<0.01,P<0.01)。此外,10mg和5mg免疫组之间的CD4~+、CD8~+T和B淋巴细胞水平差异均不显著。山羊的B淋巴细胞水平与山羊捻转血矛线虫荷虫数之间呈显著的正相关关系(r=0.587,P<0.05)。 7.捻转血矛线虫重组galectins诱导山羊的外周血粒细胞和单核细胞免疫应答 雌、雄性捻转血矛线虫重组galectin蛋白免疫山羊后,对所有试验山羊的外周血中嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞和血红蛋白进行了检测。结果显示,攻虫前,10mg和5mg免疫组山羊的嗜酸性粒细胞浓度显著高于不攻虫对照组(P<0.01,P<0.01);10mg免疫组山羊的嗜中性粒细胞浓度显著高于不攻虫对照组(P<0.01);10mg和5mg免疫组山羊的单核细胞水平逐渐上升;各组山羊的血红蛋白浓度没有明显差异。攻虫后,10mg、5mg免疫组和攻虫对照组山羊嗜酸性粒细胞浓度显著高于不攻虫对照组(P<0.01,P<0.01,P<0.01);10mg免疫组的嗜中性粒细胞浓度明显高于攻虫对照组(P<0.05);5mg免疫组和攻虫对照组山羊的单核细胞浓度明显高于不攻虫对照组(P<0.05,P<0.01);两个免疫组和不攻虫对照组的血红蛋白水平显著高于攻虫对照组(P<0.05,P<0.05,P<0.01)。此外,10mg和5mg免疫组之间的粒细胞、单核细胞和血红蛋白水平差异均不显著。山羊的嗜酸性粒细胞浓度与累积EPG之间存在正相关关系(r=0.537);单核细胞浓度与山羊荷虫数之间存在明显的正相关关系(r=0.636,P<0.05);血红蛋白浓度与山羊荷虫数之间存在显著的负相关关系(r=-0.744,P<0.05)。……   
[关键词]:捻转血矛线虫;半乳糖结合凝集素;山羊;细胞因子;细胞凋亡;免疫保护
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南京农业大学2006年