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神经保护短肽体内分泌表达策略和治疗作用的研究

杨宇

   近年来人们发现了许多神经保护短肽具有很强的神经保护作用,而且它们的分子量小,能够自由通过血脑屏障,在AD等中枢神经系统疾病的治疗中具有广阔的前景。然而神经保护短肽在临床应用中普遍存在着半衰期短,人工合成的价格昂贵等问题。为了能将神经短肽用于中枢神经系统疾病的治疗,本研究构建了携带融合基因NT4-NAP的慢病毒载体,实现了神经保护短肽NAP在体内的持续分泌表达,通过体外细胞学实验和闭合性脑损伤动物模型证实了可分泌表达NAP的重组慢病毒具有较强的神经保护作用。 为了实现重组慢病毒能在体内持续分泌表达的目的和证实其神经保护作用,本研究进行了以下实验:1、构建分泌表达NAP的重组慢病毒采用PCR方法,克隆了融合基因NT4-NAP cDNA,应用重组病毒包装技术构建了可分泌表达神经保护肽NAP的重组慢病毒。2、建立APPsw转基因细胞模型利用逆转录病毒载体,在神经母细胞瘤细胞内表达突变β淀粉样肽前体蛋白APPsw基因。3、通过体内外实验验证可分泌表达NAP的重组慢病毒的神经保护作用①选用构建的AD细胞模型,体外感染重组慢病毒rLent/NT4-NAP,通过RT-PCR检测NT4-NAP基因在细胞内的表达情况、观察形态学改变、MTT检测细胞增殖活力、Annexin V/PI法流式细胞术检测各组细胞凋亡和坏死情况。②通过重锤加害的方法,制备闭合性脑损伤小鼠模型,滴鼻给予重组慢病毒rLent/NT4-NAP,观察并计算各组小鼠死亡率、动物行为学改变做NSS评分、干湿重法检测脑水肿量、病理改变和荧光蛋白表达情况。 主要研究结果及结论:①基因测序和琼脂糖凝胶电泳结果证实融合基因正确插入pLenti6/V5TOPO,感染报告病毒的细胞荧光阳性率可达90%以上,表明成功构建了能够分泌表达NAP的重组慢病毒载体,重组病毒能够高效的转染人神经母细胞瘤细胞。②MTT检测和流式细胞术结果表明在转基因模型细胞中表达的APPsw基因具有明显的细胞毒性效应,可诱导细胞产生了以凋亡方式为主的细胞死亡,结果证明成功构建了APPsw转基因的AD细胞模型。③分泌表达NAP的重组慢病毒,能够明显增加APPsw转基因细胞细胞数量,改善其活力,减少细胞的凋亡和坏死,说明重组病毒表达的蛋白能对AD细胞模型起到很好的保护作用。④闭合性脑损伤(CHI)组小鼠死亡率和NSS评分都明显高于经滴鼻给予分泌表达NAP的重组慢病毒(rLent)组;rLent组的动物的行为能力、平衡和警觉性明显比CHI组受损轻;rLent组小鼠脑水肿含量低于CHI组,证明分泌表达NAP的重组慢病毒能够改善闭合性脑损伤小鼠的神经功能。⑤经滴鼻给予小鼠报告病毒后,可在鼻粘膜处见呈条索样的绿色荧光,而在嗅神经及大脑则没有发现荧光。实验结果显示重组病毒可感染鼻粘膜细胞,分泌表达的NAP蛋白能够改善闭合性脑损伤小鼠的神经功能。研究结果为进一步应用其他神经保护短肽提供了可靠的技术手段,为中枢神经系统疾病的基因治疗开辟了新的途径。……   
[关键词]:神经保护短肽NAP;融合基因;慢病毒载体;基因治疗
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:吉林大学2007年
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