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OxyR蛋白调控鼠疫耶尔森氏菌抗氧化杀伤作用的研究

邱业峰

   利用一步法突变技术成功构建了鼠疫菌?oxyR突变株。为了证实鼠疫菌OxyR蛋白与H2O2抗性的相关性,我们设计了一系列H2O2抗性的表型实验,结果表明oxyR基因是否表达与鼠疫菌抵抗H2O2的杀伤作用直接相关。 巨噬细胞内存活与繁殖是鼠疫菌得以最终致病的关键阶段。感染巨噬细胞实验结果表明,鼠疫菌野生株和?oxyR突变株感染巨噬细胞的相关的黏附吞噬率差异不显著,说明OxyR在鼠疫菌感染巨噬细胞的黏附过程没有发挥明显作用。而感染巨噬细胞吞噬率差异显著,提示OxyR可能在鼠疫菌抵抗巨噬细胞吞噬的过程中发挥作用。 通过鼠疫菌全基因组DNA芯片,对鼠疫耶尔森氏菌H2O2刺激元和OxyR调控元进行了的研究,H2O2刺激元转录谱分析结果显示,鼠疫菌的抗氧化机制主要包括清除活性氧(katA和katY)调控元、渗透压相关蛋白、修复DNA损伤(SOS调控元)和cys调控元等。OxyR调控元转录谱分析鉴定了大量OxyR调控元基因,进一步证实了oxyR通过调控oxyR调控元发挥抗氧化作用。 结合转录谱结果和生物信息学知识,挑选了14个基因作为研究对象,在大肠杆菌中表达并纯化了可溶性的OxyR蛋白后,通过凝胶迁移实验(EMSA)证实了OxyR蛋白能够结合这些基因启动子区,说明了这些基因受OxyR调节蛋白直接调控。 利用了DNA酶I足迹实验和引物延伸实验对过氧化氢酶基因katA和过氧化物酶基因katY进行研究,确定了OxyR蛋白结合这两个基因启动子区的位置和序列,以及这两个基因的转录起始位点。 本研究的主要创新之处是通过全基因组DNA芯片,确定了鼠疫耶尔森氏菌H2O2刺激元和OxyR调控元。通过凝胶迁移实验、DNA酶I足迹实验和引物延伸实验证实了部分的OxyR调控元基因。……   
[关键词]:鼠疫耶尔森氏菌;OxyR调控蛋白;刺激元;调控元;凝胶迁移实验;DNA酶I足迹实验;引物延伸实验
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:吉林大学2007年