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蝶蛹金小蜂卵黄发生与卵子发生的生理与分子基础

董胜张

   本论文选择了菜粉蝶Pieris rapae蛹期的优势内寄生蜂——蝶蛹金小蜂Pteromalus puparum作为研究对象,在制备该蜂Vt单克隆抗体和解析Vg cDNA序列的基础上,分别从生理生化、细胞和分子水平对其卵黄发生、卵子发生和生殖调控的机制进行了系统的研究。主要结果概括如下: 1.Vt的纯化与生化特性 非变性PAGE电泳结果表明,在雌蜂的血淋巴中和成熟卵内存在一条雌性特异蛋白条带,而在雄蜂的血淋巴中未发现相对应的条带,该蛋白条带能被脂蛋白、糖蛋白和磷酸化蛋白特异性染色。因此推测此雌性特异条带为该蜂的Vt,而雌蜂血淋巴中对应的为Vg,其天然分子量约为370 kDa。SDS-PAGE分析表明,Vg/Vt是由分子量分别约为205和165kDa的两个亚基组成。通过P-100凝胶过滤层析和Q-1阴离子交换层析的方法,从卵内可溶性蛋白中纯化出Vt。双向电泳分析表明,成熟卵内可溶性蛋白约由118个点组成,等电点主要集中于5~8.5之间,分子量主要集中于130~250 kDa和25~50 kDa两个范围,Vt约占到总蛋白的50~70%,Vt两个亚基的等电点均约为8.2。 2.Vt单克隆抗体的制备与应用方法的建立 采用杂交瘤细胞技术,分别制备得4株能稳定分泌抗蝶蛹金小蜂Vt的单克隆抗体(mAb),即PpVt mAb1、PpVt mAb2、PpVt mAb3和PpVt mAb4。4株单抗分别制取了腹水,其腹水上清的效价均达到10~5以上,且对PpVt mAb1的腹水进行了纯化。4株单抗免疫球蛋白的重链和轻链的亚类均为IgG1和κ类型。 不同组织的Western免疫印迹结果表明,mAb不仅特异性识别卵巢内Vt,而且识别雌蜂血淋巴中Vg,但与雄蜂血淋巴无反应,可以用于Vg/Vt的定性或定量检测。通过对直接ELISA、间接ELISA、异种双抗夹心ELISA和异源双抗夹心ELISA方法的比较,确定了微量检测蝶蛹金小蜂体内Vg/Vt的最适ELISA方法,即异源双夹心ELISA法。该方法可用于单头雌蜂体内Vg/Vt的定量检测,其检测灵敏度约为20 ng/mL。 3.卵巢发育与卵黄发生 蝶蛹金小蜂的卵巢由3对卵巢管组成。在羽化后的48 h内,该蜂的卵巢管由透明、细丝状变为充满成熟卵的饱满状。该蜂血淋巴中Vg的出现始于隐成虫期,其含量在羽化后24 h内快速增加,从刚羽化时的170 ng/female增加到24 h的580 ng/female,随后便开始减少,但是,48 h后又开始增加。雌蜂羽化时,卵母细胞即开始摄取Vg,卵巢内Vt开始沉积。羽化后48 h内其含量快速增长,且在48 h,达到最高,约为4.51μg/female,而后则开始减少,到72 h,仅有3.9μg/female。此外,卵巢内Vt的含量与卵巢发育进度存在显著的相关性。 4.卵子发生及其细胞凋亡 根据卵子的形态变化可将蝶蛹金小蜂的卵子发生分为5个时期,即卵室(egg chamber)形成期(S1)、滋养细胞和卵母细胞分化期(S2)、滋养细胞快速增长期(S3)、卵母细胞快速增长期(S4)和卵子成熟期(S5)。该蜂的生殖细胞囊(cyst)由1个卵母细胞和15个滋养细胞,以及周围的滤泡细胞构成。细胞间主要通过F-actin为基础的细胞骨架连接,滋养细胞与卵母细胞通过营养管(nutritive appendix)相互连接。采用激光共聚焦显微技术、冷冻切片技术和细胞免疫定位技术研究表明,卵母细胞对Vg的摄取主要发生在S3时期,而滋养细胞中的细胞质转移到卵母细胞主要是发生在S4时期。TUNEL和PI双染色的结果表明,滋养细胞的凋亡始于S4前期,至S4中期,其大多数处于凋亡状态,到S4后期大部分滋养细胞已经死亡,只有少数尚处在凋亡状态。卵母细胞周围滤泡细胞的凋亡,始于S4后期。对S5时期卵子的电镜观察发现,其卵内主要含有卵黄颗粒和脂滴,卵壳的结构与其它昆虫相似,主要有卵黄膜、卵壳的内外层和基膜组成。 5.胚胎发育与卵黄蛋白的降解 蝶蛹金小蜂胚胎发育主要发生在寄生产卵后的36 h内,而在42 h,则开始孵化。对不同发育时期胚胎内蛋白的SDS-PAGE和Western免疫印迹分析发现,在寄生产卵后18 h内,Vt被降解成分子量较小的一些多肽,其中有9个多肽与Vt具有相似的抗原决定簇,能够被抗Vt的单克隆抗体所识别,其它小肽则不被识别,而在寄生产卵后24 h,胚胎内Vt完全被降解成不被抗体所识别的小肽。同时,胚胎内Vt含量在寄生产卵后12 h内,由刚产时的203 ng增加到12 h的359 ng,但12 h后快速减少,至42 h仅有57 ng,随后便检测不到。 6.卵黄发生的内分泌调控 蝶蛹金小峰成虫体内主要含有JHⅢ,其滴度在羽化后2 d内呈增长趋势,从刚羽化时的1.6pg/female增加到羽化后48 h的20 pg/female,此后,则开始减少,至羽化后第5 d,JHⅢ仅有25 pg/female。该蜂体内蜕皮激素的滴度在成虫羽化后急速减少,由刚羽化时的413 pg/female减少到12 h的175 pg/female,随后便开始增加,至羽化后24 h,体内蜕皮激素的滴度上升到234 pg/female,此后又快速降低。 采用不同浓度的JHⅢ(20 ng/♀、100 ng/♀和500 ng/♀)处理刚羽化雌蜂的结果表明,JHⅢ不能显著促进Vg的合成,但高浓度的JHⅢ(500 ng/♀)显著提高卵巢对Vg的摄取。雌蜂体内JHⅢ的滴度与卵巢内Vt存在显著的正相关,而与血淋巴中Vg和脂肪体中VgmRNA的含量相关性不显著。采用不同浓度的蜕皮激素(20-E)处理刚羽化雌蜂的结果表明,20-E能促进Vg的合成,但高浓度的20-E(25 ng/♀和125 ng/♀)显著抑制卵巢对Vg的摄取,而低浓度的20-E(5 ng/♀)对Vg的摄取无明显影响。该蜂体内20-E的滴度与脂肪体中Vg mRNA的含量存在显著的正相关,而与血淋巴中Vg和卵巢内Vt均无明显的相关性。刚羽化的雌蜂去头后,仍能完成卵黄发生与卵子成熟。 综合以上结果可以推测,蝶蛹金小蜂的卵黄发生主要受蜕皮激素调控,而保幼激素只是起到辅助作用。在蛹的后期和隐成虫期,蜕皮激素滴度的下降启动了脂肪体Vg mRNA的合成。一旦Vg的转录反应被启动后,Vg mRNA的合成便受到蜕皮激素的正调控。 7.营养和交配对卵黄发生与卵成熟的影响 喂食蜂蜜水不仅能够显著促进了蝶蛹金小蜂Vg的合成与摄取,而且显著提高了卵巢内卵子室数和成熟卵的比例。但是,取食蔗糖水和交配对卵黄发生的影响不明显。 8.脂肪体cDNA表达文库的构建与分析 以羽化后1 d雌蜂的脂肪体为材料,用ZAP Express~(?) Vector载体构建了一个cDNA表达性文库。该文库的原始滴度约为1×10~5 pfu/mL,扩增后的滴度约为1×10~8 pfu/mL,该文库的重组率约为95.82%,外源插入cDNA片段大小在0.5~2.5 kb之间。对随机挑取的重组克隆序列测定,初步获得103条ESTs序列,序列平均长度为600.74 bp。获得的ESTs序列主要包括细胞看家功能基因(65.5%)、信号转导相关的基因(12.5%)、基因转录和调控相关的蛋白(18.6%)。 9.Vg基因的克隆及其体内表达的分析 用抗Vt的单克隆抗体对脂肪体cDNA表达文库进行免疫筛选,从1×10~5个噬菌斑中获得了24个阳性克隆。对阳性克隆的序列测定,获得了该峰Vg的3端序列,约含有2530bp。用5 RACE的方法克隆了该蜂Vg的5端序列,并与前面测定的3端序列进行合并,获得了Vg cDNA的全序列。该序列含有5634 bp,编码1803个氨基酸,推测的分子量为202.94 kDa,等点PI=8.22,在GenBank中的登录号为EF468683。该序列含有4个推测的Vg酶切位点(RXXR),保守的结构区域GLCG和DGXR,同时在C-末端存在9个保守的半胱氨酸。通过Edman降解测定Vt1的N末端20个氨基酸位于Vg序列的第18~37氨基酸之间,因此推测前面的17个氨基酸为Vg的信号肽序列。 根据克隆的基因序列和该蜂保守的18S rRNA序列设计引物,建立了荧光定量PCR方法,并用来检测其体内Vg mRNA相对含量的变化。脂肪体中Vg mRNA从雌蜂的黑蛹期开始合成,但其相对含量较低,羽化时达到最高,且在羽化后12~24 h内维持较高的水平,随后则开始快速降低。雄蜂和雌蜂白蛹期的脂肪体中未检测到Vg mRNA。雌蜂血淋巴中Vg与脂肪体中Vg mRNA,不论是在某个特定时期,还是在总体上,都存在着显著的正相关,只是后者的出现约比前者提前了约24 h。 蝶蛹金小蜂Vg氨基酸序列与其它膜翅目昆虫具有较高的相似性,与丽蚜小蜂、日本瘤姬蜂、菜叶蜂、意大利蜜蜂、红火蚁Vg1、红火蚁Vg2、红火蚁Vg3分别为55.4%、40.7%、37.9%、35.4%、35%、32.7%、30.8%。此外,对40个物种Vg的分子进化分析表明,昆虫Vg的进化上基本上与其分类地位相一致。……