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茶树遗传转化及UV-B对香气相关基因表达影响的研究

张广辉

   茶树(Camellia sinensis(L.)O.Kuntze)属山茶科,是重要的饮料作物。茶树为多年生木本植物,其自身的一些特性,如长生育周期、自交不亲和性、高度自交衰退等,使人工杂交或自交进行的遗传改良受到诸多限制。因此通过遗传转化进行茶树育种越来越受到研究者的重视。离体再生困难和转化效率低是限制茶树遗传转化进行的主要因素。作者在综述了茶树离体植株再生和遗传转化的主要进展基础上,提出发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)介导法最有可能在茶树遗传转化上取得成功。 茶氨酸(N-乙基γ-L-谷氨酰胺)是茶树的特征性氨基酸。茶树体内,茶氨酸仅以游离状态存在,是优势氨基酸种类,占茶叶干重的1~2%,占总游离氨基酸总量的50%左右。茶氨酸具有缓解精神压力、降血压、提高学习能力等生理活性,作为食品添加剂广泛应用于饮料、糖果和冰激凌等食品中。茶树细胞培养是茶氨酸的生物合成方法之一,但细胞培养存在遗传不稳定,次生代谢物含量容易降低等问题。根系是茶氨酸生物合成的最重要的器官,发根农杆菌侵染植物后能够产生遗传稳定的发状根,发状根培养是一个有效的茶氨酸生产系统,能够成为一种离体生产茶氨酸的方法。 咖啡因是一种嘌呤生物碱,化学名称为1,3,7-三甲基黄嘌呤。咖啡因存在于茶咖啡中而被人们所熟知。尽管咖啡因对人体的长期影响尚不明确,但其短期副作用已越来越受到人们的重视,这些副作用包括引起心悸、胃肠失调、焦虑、震颤、血压升高和失眠等。脱咖啡因的咖啡和茶日益受到市场的欢迎。利用工业方法生产脱咖啡因咖啡和茶,成本过高,而且造成滋味和香气的损失。因此,研究利用生物技术途径降低茶树或咖啡中咖啡因的含量就具有十分重要的理论和应用价值。作者综述了咖啡因生物合成的研究进展,认为利用RNAi抑制相关基因表达是培育低咖啡因茶树的最有效途径。为解决茶树遗传转化困难的问题,作者提出一个培育低咖啡因茶树的新策略,即在发状根中表达咖啡因合成酶(TCS)基因的发夹RNA(hpRNA),利用RNAi诱导的基因沉默的系统传递性抑制茶树叶片和芽中TCS基因的表达,进而抑制咖啡因的生物合成,降低其含量。 香气是决定各种成茶特别是乌龙茶和红茶特性与品质的重要因子之一。近年来,随着生活水平的提高,人们对茶叶香气品质的要求越来越高,高香名优茶已成为茶业发展的重要方向之一。目前对UV-B辐射处理引起植物细胞损伤、代谢途径和信号转导途径改变等的研究很多,UV-B也是许多基因表达的诱导因子。茶叶中许多香气成分是以非挥发的结合态形式存在,只有在相关水解酶作用下才能转变为可挥发的香气物质。本研究拟通过对茶树离体鲜叶进行不同时间的UV-B辐射,分析UV-B处理后成品茶香气组成的变化,优选出UV-B辐射增香的最佳条件,为利用该技术开发相应的高香茶生产工艺创造条件;同时研究UV-B辐射处理对茶叶香气形成相关的酶基因表达影响,明确UV-B辐射增香生理生化和分子生物学机理。 1.以两种野生型发根农杆菌菌株、三种共培养培养基和六种外植体为试材,建立了茶树发状根高频诱导体系,最高发状根诱导频率达30%以上。最佳发状根诱导体系为:OD_(600)为0.5~0.8的发根农杆菌菌液侵染已培养60~70d苗龄无菌苗茎段10~50min,在添加100 mmol/L乙酰丁香酮的YMB固体培养基上共培养2 d,在含500 mg/L头胞噻肟钠的MS培养基上诱导发状根。发状根在不含激素的LG_0培养基上生长迅速,产生大量侧枝和根毛。PCR证实,发根农杆菌Ri质粒T-DNA的rolA、rolB和rolC基因已经插入到发状根基因组DNA中。应用此发状根诱导体系,以含携带Bt基因的双元载体质粒pCAMBIA2301的发根农杆菌15834,侵染茶树外植体诱导出发状根,PCR和GUS组织化学染色证实外源基因已经插入到基因组DNA中并获得表达。 2.茶树发状根在LG_0培养基和添加1mg/L IBA的1/2MS培养基上生长迅速,但只在一个培养于LG_0培养基的发状根克隆中检测到高含量的茶氨酸,含量达到23.12 mg/g鲜重,显著高于对照未转化根的18.77 mg/g鲜重。除茶氨酸外,该发状根克隆中也检测到高含量的天门冬氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺和精氨酸。将高茶氨酸的发状根克隆培养于添加1 mg/L IBA的1/2MS培养基,茶氨酸的含量则显著降低,说明培养基组成也是影响发状根中茶氨酸的含量的因素之一。同时,在茶树发状根中也检测到低含量的儿茶素类化合物,主要为儿茶素和表儿茶素。 3.咖啡因合成酶(TCS)是茶树咖啡因生物合成途径中的一个关键酶,催化7-甲基黄嘌呤转变为可可碱和可可碱转变为咖啡因,抑制TCS基因表达是培育低咖啡因茶树的最有效途径。用RT-PCR方法扩增茶树TCS基因的两个cDNA片段,并克隆入T-载体中。干涉载体和TCS基因片段的T克隆经限制性内切酶两次双酶切与连接,将两个TCS基因片段分别反向重复插入到干涉载体pFGC5941,构建了TCS基因的RNA干涉载体pFGC5941-TCS02和pFGC5941-TCS03。经PCR和DNA测序获得验证。TCS基因RNA干涉载体的构建为培育低咖啡因茶树奠定了基础。以携带TCS基因RNAi表达载体的发根农杆菌15834和LBA9420侵然茶树无菌苗茎段,诱导产生发状根。 4.香气是决定各种成茶特性和质量的最重要的因素之一。利用RT-PCR和GC-MS研究了UV-B处理对β-樱草糖苷酶与β-葡萄糖苷酶基因表达和离体茶树叶片香气成分的影响。结果表明,短时间UV-B处理后茶叶β-樱草糖苷酶与β-葡萄糖苷酶基因的表达量升高,同时短时间UV-B处理能够加速香气成分的释放,显著提高芳香醇类成分如芳樟醇、苯甲醇和苯乙醇的含量。说明短时间UV-B处理主要通过刺激糖苷水解酶的基因活性,从而使更多的香气前体被水解并释放出香气成分。……