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外科监护室铜绿假单胞菌多重耐药机制研究

衣美英

   铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginos,P.aeruginosa,PA),是医院内感染常见的条件致病菌之一,且PA对多种抗生素存在天然和获得的多重耐药性,临床治疗十分困难,尤其在重症监护室,一旦感染,病死率极高。因此对PA耐药机制的研究,一直是国内外学者研究的重点和难点,但PA耐药机制非常复杂,尤其是其形成多重耐药的机制一直难以确定。外科重症监护室(Surgical Intensive CareUnit,SICU)是PA感染最严重的科室,耐药率高,耐药谱广,常表现为多重耐药。因此,为了解北京大学第一医院SICU铜绿假单胞菌多重耐药机理,我们进行了如下研究: 1.耐药表型及β-内酰胺酶的基因型测定 2001年7月至2004年7月,从北京大学第一医院SICU临床标本中分离出49株非重复PA,并经脉冲场凝胶电泳证实为非流行株。按美国国家临床试验室标准委员会(NCCLS,2002年)所推荐的琼脂倍比稀释法,测定抗生素的最小抑菌浓度(MICs);提取β-内酰胺酶进行三维水解试验及等电聚焦电泳(IEF);通过一系列超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及金属酶(MBLs)特异引物扩增其耐药基因。 结果:受检49株PA均对4种或4种以上抗生素耐药,表现为多重耐药,其中对三代头孢菌素头孢噻肟、喹诺酮类环丙沙星和左氧沙星、碳青霉烯类亚安培南耐药率较高,分别为98%、80%、92%和84%。而对哌拉西林+他唑巴坦(特治星)、第四代头孢菌素头孢吡肟、氨基糖苷类抗生素阿米卡星耐药率较低,分别为6%、6%、4%。 48株菌产β-内酰胺酶(98%),其中37株产AmpC酶(75.5%),11株产ESBLs酶(22.4%),未发现产金属酶的菌株。所有被三维试验确定为产ESBLs的11株PA,有8株扩增到OXA酶编码基因。以SHV,CTX-M1,CTX-M3,CTX-M10,VEB,IMP,VIM特异引物进行PCR扩增,未发现阳性菌株。 2.4种主动外排系统高表达情况及调控机理研究 用Western印迹测定外排泵MexCD-OprJ、MexEF-OprN的结构蛋白OPrJ、OprN表达情况;用半定量RT-PCR和荧光定量RT-PCR分别测定MexAB-OprM、MexXY-OprM结构基因mexA、mexX的mRNA表达水平,借此来判断4种外排泵表达情况。 结果:49株多重耐药PA,31株高表达主动外排系统(63%),其中27株菌高表达MexAB-OprM,3株菌高表达MexXY-OprM,13株菌表达MexCD-OprJ,14株菌表达MexEF-OprN,并且多重表达现象非常普遍,17株菌同时表达2种或2种以上外排泵,其中PA22、PA39两株菌同时表达4种,PA23、PA45、PA13三株菌同时表达3种。经统计学分析,在MexAB-OprM高表达组和低表达组美罗培南、头孢哌酮/舒巴坦的耐药率有显著差异,而其它抗生素耐药率虽然无显著差异,但MexAB-OprM高表达组大部分菌株对哌拉西林/克拉维酸、头孢噻肟、氨曲南的MIC比参考菌PA01高2-32倍,这些抗生素均为MexAB-OprM外排泵很好的底物。MexXY-OprM外排泵高表达的菌株PA39,表现为对庆大霉素高度耐药(MIC为512),加泵抑制剂后,MIC下降4倍,说明MexXY-OprM高表达是PA39对庆大霉素高度耐药的机制之一。MexCD-OprJ、MexEF-OprN高表达组和未表达组对14种抗生素MIC及耐药率虽然无显著性差异,但表达MexCD-OprJ系统的13株菌对第四代头孢菌素头孢吡肟的MIC比参考菌PA01高2-32倍,PA31、PA34两株菌同时对环丙沙星和左氧沙星耐药,头孢吡肟、环丙沙星和左氧沙星均为MexCD-OprJ的底物,这些菌株对此三种药物的耐药可能与MexCD-OprJ表达有关。表达MexEF-OprN外排系统的PA8、PA22、PA23、PA39、PA41、PA45、PA46 7株菌,对亚胺培南的MIC比参考菌PAO1高16-32倍,PA23、PA39、PA45、PA14同时对环丙沙星和左氧沙星耐药,推测这些菌株对此三种药物的耐药可能与MexEF-OprN表达有关。 随机选择10株mexA高表达的菌株、2株mexX高表达的菌株、5株OprJ表达的菌株,分别扩增其调控基因mexR、moxZ、nfxB,测序并与genebank中公布的序列比较,发现7株菌发生mexR基因突变,出现氨基酸替代,其中PA18、PA43、PA48、PA49四株菌发生69Thr-Ala替代,PA14、PA36两株菌发生130Thr-Ser替代,PA41发生95Leu-phe替代,PA22菌株mexR基因在7773和7775之间插入碱基a,在32位氨基酸提前出现终止密码子,使长度为184个氨基酸的MexR蛋白截短为31个氨基酸,PA46、PA39两株菌未发现mexR基因突变。2株mexX高表达的菌株均发生基因mexZ突变,出现氨基酸替代,其中PA39发生7Glu-Gly替代,PA22发生21Glu-Asp和26Glu-Lys替代。5株OprJ表达的菌株中,2株菌发生nfxB基因突变,出现氨基酸替代,其中PA31发生55Glu-Gln替代,PA33发生82Arg-Leu替代,3株菌未发现nfxB基因突变。因PA36、PA41、PA48的mexR基因序列未见报导,我们把其序列提交到genebank,申请的序列号分别为AY899299、AY899300、AY899301。 3.外膜孔蛋白OprD水平测定 为进一步了解PA对碳青霉烯的耐药机理,我们用Western印迹测定外膜孔蛋白OprD的表达情况,并分析了其表达水平对其他抗生素耐药性的影响。 结果:从SICU分离的49株多重耐药PA,与PA01相比,41株OprD降低或缺失,其中,18株表达降低,23株表现为丢失。8株菌正常表达了OprD,其中7株对碳青霉烯敏感,1株(PA42)对美罗培南耐药但对亚胺培南敏感。41株OprD缺失或低表达菌,均表现为对亚胺培南耐药(MICs16~32ug/ml);大部分(27株)对美罗培南敏感,只有14株对美罗培南耐药。OprD表达量,在亚胺培南耐药组(中位数=2.00,Q1/Q3=2/2)和敏感组(中位数=0.21,Q1/Q3=0.00/0.73)有显著差异(u=0.5,p=0.007<0.01)。但在美罗培南耐药组(中位数=1.00,Q1/Q3=1/2)和敏感组(中位数=0.21,Q1/Q3=0.00/0.73)无显著差异(u=231.5,p=0.59>0.05)。在OprD正常表达组和低表达组对亚胺培南耐药率有显著差异,而对美罗培南耐药率无显著差异。 OprD缺失,不但影响碳青霉烯的敏感性,同样影响氟诺喹酮和β-内酰胺的敏感性,在OprD正常表达组和低表达对环丙沙星、左氧沙星、氨曲南、哌拉西林耐药率均有显著差异。 通过本研究我们得到如下结论: 1.本院SICU多重耐药铜绿假单胞菌检出率很高,持续高产AmpC酶是其耐药的主要β-内酰胺酶酶学机制,OXA酶是超广谱β-内酰胺酶的主要类型。未检出其他超广谱β-内酰胺酶及IMP、VIM金属酶。 2.主动外排系统在SICU多重耐药铜绿假单胞菌表达率很高,是此菌多重耐药机制之一;外排泵MexAB-OprM、MexCD-OprJ、MexXY-OprM高表达分别与调控基因mexR、nfxB、mexZ发生变异有关,同时存在其它调控机制。 3.外膜孔蛋白OprD丢失主要引起亚胺培南耐药,同时对环丙沙星、左氧沙星、氨曲南、哌拉西林耐药性也有一定影响。……   
[关键词]:铜绿假单胞菌;β-内酰胺酶;多重耐药;主动外排系统;外膜蛋白
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中科技大学2006年