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彗星试验检测冷冻大鼠肝脏和肌肉细胞辐照后DNA损伤研究

胡群

   1、目的 食品辐照是一种新兴的食品保鲜技术,该技术运用X射线、γ射线或电子高速射线辐射食品,使食品中产生物理或化学反应,抑制或破坏其新陈代谢和生长发育,杀灭食物中的害虫和微生物,从而达到消毒保鲜、延长食品贮藏销售时间、减少损失的目的。辐照杀菌的机制是:X射线、γ射线或电子高速射线发出的能量以电磁波的形式透过物体,当物质中的分子吸收辐射能量时,会激活成离子或自由基,引起化学键破裂,物质内部发生变化。更重要的是,遗传物质DNA会因化学键裂解而失去复制能力。在细菌细胞中DNA任何微小变化都会损害整个细胞体,影响其正常功能,抑制生长发育和新陈代谢,实现杀虫灭菌。被人称之为最有效的冷灭菌方法,目前食品辐照技术已日趋成熟,辐照食品也已逐步形成商业化。 但是至今仍有一些国家拒绝辐照食品,对其进出口的限制甚严。我国也相应建立了有关的标准和法规,并在不断开展辐照食品检测方法的研究。首先,开展辐照食品的检测方法研究和建立相关标准法规,并不是反对辐照食品的推广,而是更好的保证辐照食品的优质,防止无辐照食品上市和劣质食品用辐照灭菌加以掩盖后上市。其次作为出入境检验检疫部门应该了解并检测到每批进出口食品的消毒灭菌方法和手段,以便控制辐照剂量和化学残留量,提供一种有效检测手段来向消费者表明该食品的消毒灭菌方法。 目前,国内外已有一些应用于辐照食品的检测的方法研究,如用气相色谱法分析含脂肪辐照食品中形成新的碳氢化合物;用气相色谱-质谱联用法分析含脂肪的辐照食品中形成的2-十二烷基环丁酮;用电子自旋共振技术检测法(ESR)检测含纤维素、骨头和结晶糖的食品经辐照所产生的自由基;用光刺激发光法(PSL)检测含矿物质残留的食品经辐照前与辐照后激发光谱的差异;用热发光法(TL)分析含有硅酸盐粒子的辐照食品在控制加热条件下释放能量所得的TL辉光曲线。这些方法都需要相对较为复杂的仪器和昂贵设备,并且样品制备和分析过程需要较长时间。不能满足大批量样品检测的需要,因此对于新的辐照食品检测技术应用研究的要求依然十分迫切。 在肉类食品经X射线、γ射线或电子高速射线辐照处理消毒灭菌过程中,肉类组织细胞内DNA也可能会受到损伤,产生大量的单链和双链的DNA片段。这种由辐照导致DNA损伤产生的裂解物可作为辐照处理的标记物,使用一种相对简单的方法进行检测可以对辐照食品进行筛选。彗星试验技术是一种相对灵敏、简便的DNA损伤的检测技术。该技术原理是在细胞裂解液的作用下,细胞膜、核膜被破坏,RNA,蛋白质等从细胞中逸出,扩散到裂解液中,只有核DNA仍停留在原位。如果细胞未受到损伤,经荧光染色后细胞核呈圆形。如果细胞受损,在碱性条件下,DNA双链解旋成单链,片断进入凝胶。电泳时,片断由于分子量较小、本身带负电荷,在电泳场的作用下离开主核向阳极移动。经荧光染料染色后,其形状犹如彗星。细胞核DNA受损伤愈严重,产生的断裂愈多,其片断也就愈小,在电场作用下迁移的DNA量多,迁移的距离长。放射生物学研究表明,该技术可用于检测精子细胞、肿瘤细胞和淋巴细胞等哺乳动物细胞受辐照后的DNA损伤。近年来,随着科学技术的不断进步,各种有关软件的深层开发,使得这一技术增添了许多新的内涵。本研究用大鼠肝细胞和大鼠肌肉细胞为靶组织,经辐照和冷冻后,再用彗星试验来检测肝细胞和肌肉细胞的DNA损伤,从而探讨经过辐照的冰冻组织是否能用彗星试验检测出DNA损伤。为验证彗星试验应用于肉类食品是否经过辐照处理,提供实验研究的基础。 2、材料与方法 2.1样品SD大鼠六只,雌雄各半,体重约200克,由浙江省医学科学院实验动物中心提供。处死后取肝脏和肌肉组织各五份,经直线加速器辐射后冰冻保存,辐射剂量分别为0Gy、0.5Gy、1.0Gy、2.0Gy和4.0Gy。肝脏和肌肉组织冰冻保存3天后分离肝细胞和肌肉细胞。 2.2方法 取出冰冻的肝脏与肌肉组织进行细胞分离,收集细胞悬液,调整细胞密度并用台盼蓝染色计数细胞存活率,经制片、细胞裂解、电泳、中和、染色等步骤后在激光共聚焦显微镜下观察。测量彗星图像指标是彗星尾长与尾相。 3、结果 3.1大鼠肝细胞不同剂量辐照DNA损伤的检测结果 3.1.1通过对不同辐照剂量组之间彗星电泳检测的平均尾长(MTL)比较分析,发现经剂量为1.0Gy、2.0Gy、4.0Gy辐照的肝细胞与未经辐照的肝细胞DNA损伤存在明显差异(p<0.05或p<0.01)。并且用尾长所测的肝细胞DNA损伤随辐照剂量的增加而增长,DNA损伤与辐照剂量之间存在明显的剂量—反应关系(r=0.81,p<0.01)。 3.1.2通过对不同剂量组之间彗星电泳检测的平均尾相(MTM)比较分析,发现经剂量为4.0Gy辐照的肝细胞与未经辐照的肝细胞DNA损伤存在明显差异(p<0.01)。并且用尾相所测的肝细胞DNA损伤随辐照剂量的增加而增长,DNA损伤与辐照剂量之间存在明显的剂量—反应关系(r=0.69,p<0.01)。 3.2大鼠肌肉细胞不同剂量辐照DNA损伤的检测结果 3.2.1通过对不同辐照剂量组之间彗星电泳检测的平均尾长(MTL)比较分析,发现经剂量为2.0Gy和4.0Gy辐照的肌肉细胞与未经辐照的肌肉细胞DNA损伤存在明显差异(p<0.01)。并且用尾长所测的肌肉细胞DNA损伤随辐照剂量的增加而增长,DNA损伤与辐照剂量之间存在明显的剂量—反应关系(r=0.87,p<0.01)。 3.2.2通过对不同剂量组之间彗星电泳检测的平均尾相(MTM)比较分析,发现经剂量为1.0Gy、2.0Gy和4.0Gy辐照的肌肉细胞与未经辐照的肌肉细胞DNA损伤存在明显差异(p<0.05或p<0.01)。并且用尾相所测的肌肉细胞DNA损伤随辐照剂量的增加而增长,DNA损伤与辐照剂量之间存在明显的剂量—反应关系(r=0.91,p<0.01)。 4、结论 本实验检测结果表明经辐照后的冰冻大鼠肌肉细胞和肝细胞DNA损伤明显增加,且DNA损伤与辐照剂量之间存在较为明显的剂量反应关系,当辐照处理剂量达到一定程度时,以平均尾长(MTL)或平均尾相(MTM)为指标进行统计学分析,辐照与未经辐照的样品内细胞DNA损伤存在明显差异,从而可以区分辐照与未辐照的样品。这为彗星试验应用于辐照肉类食品检测提供了一定的实验研究的基础。……   
[关键词]:彗星试验;肝细胞;肌肉细胞;DNA损伤
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江大学2006年