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复合生长因子和基因制备促血管再生活性支架的研究

毛峥伟

   随着再生医学/组织工程的发展,人们对支架材料的要求也不再局限于生物相容性,而要求支架具有生物活性,能够促进细胞增殖、分化,从而引导组织再生。 本文首先尝试了用生长因子构建活性支架。采用层层自组装技术,在TCPS表面成功地构建了(aFGF/heparin)/PEI自组装多层膜。体外成纤维细胞培养的结果证明,aFGF在多层膜中仍然保持一定的生物活性,可促进成纤维细胞增殖并促进Ⅰ型胶原和白介素6的分泌。体外PBS浸泡实验显示(aFGF/heparin)/PEI多层膜具有一定的稳定性,但浸泡48h后,多层膜的生物活性显著下降,而保存在-20℃可以有效地保持多层膜的生物活性。将层层自组装技术成功地应用于胶原多孔支架的改性,构建了具有生物活性的胶原支架。成纤维细胞在该支架中的MTT活性有所提高,但不显著。 针对生长因子活性不易保持、难以控释、价格昂贵等缺点,我们进行了将表达生长因子的基因及其载体与组织工程支架相结合,从而构建活性支架的探索。我们制备了N-三甲基壳聚糖(TMC)和N-三甲基壳寡糖(TMO),可通过反应时间控制其季铵化程度。TMC/TMO可与DNA通过静电作用形成几百纳米大小的微粒,其尺寸受N/P值调控。较高的季铵化程度可以获得较小的复合物微粒。载体与DNA的结合能力随着季铵化程度的增加而增大,形成复合物的表面电势亦随之增大。载体的毒性随季铵化程度和分子量的增加而增大。细胞对复合物微粒的吞噬量随着TMC的季铵化程度增加而增加,但载体的基因转染能力随季铵化程度增加而先增加后降低,其转染能力优于PEI,但仍低于Lipofectamine2000。 制备了聚N-异丙基丙烯酰胺和TMC的接枝共聚物(TMC-g-PNIPAAm),其LCST为32℃。TMC-g-PNIAAm共聚物的LCST随盐溶液浓度的增大而减小,但不受pH值影响。TMC-g-PNIPAAm/DNA微粒的大小在200~900nm之间,温度对微粒粒径的影响不显著。微粒的表面电势和TMC-g-PNIPAAm与DNA的结合力受温度调控。接枝PNIPAAm对37℃下的细胞吞噬行为没有明显影响。TMC-g-PNIPAAm/DNA微粒的基因转染效率受温度调控,降低温度可以显著提高TMC-g-PNIPAAm的基因转染效率。其最佳转染效率与Lipofectamine2000相当,而细胞毒性则显著低于Lipofectamine2000。 以二氧化硅微粒为模型,在其表面接枝Tat多肽。Tat接枝量可由投料量控制,并且接枝Tat对微粒的物理性质无显著影响。发现Tat多肽可介导细胞对微粒的吞噬,同时还会改变胞吞后微粒在细胞内的分布,可将微粒导入细胞核区。使用戊二醛可以有效地将Tat多肽接枝到TMO/DNA微粒上,通过反应条件可控制Tat接枝量。接枝Tat多肽对TMO/DNA微粒的物理性质和细胞毒性无显著影响,但可显著提高细胞吞噬量和基因转染效率。 以表达VEGF的质粒DNA为模型,将载体/DNA微粒通过物理吸附的方法复合到胶原支架中,结合量受微粒浓度调控。载体/DNA微粒在支架中有一定的缓释能力。将负载载体/DNA微粒的胶原支架埋植到大鼠体内,发现可显著促进血管长入支架并提高支架内血管密度。并且随着DNA浓度提高和载体的转染效率提高,其促血管生成能力也相应提高。证明负载基因的活性支架在诱导组织/血管再生方面有良好的应用前景。……   
[关键词]:再生医学;组织工程;基因传递;活性支架;血管化;N-三甲基壳聚糖;温度响应;Tat多肽
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:浙江大学2007年
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