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环境内分泌干扰物对神经母细胞瘤生长的影响

郑继翠

  研究背景与目的:近年来,随着人类生产活动的飞速发展,环境内分泌干扰物(EED)的污染已成为全球关注的重要议题。EED主要来源于杀虫剂、塑料、洗涤剂、燃烧产物及工农业产物,这些物质进入机体后,干扰内分泌系统功能,从而对机体产生一系列的不良反应。最近,EED对性激素敏感性恶性肿瘤的影响成为研究热点,但有关EED和儿章肿瘤相关性的报道还很少。神经母细胞瘤是儿章好发的恶性胚源性肿瘤,其病因不明,孕前或孕期中父母及儿章早期的环境暴露因素日益受到关注。实体瘤的生长很大程度上依赖于血管生成,而神经母细胞瘤具有较强的致血管形成性和血管依赖性,此点已经引起人们的极大兴趣。EED是否对神经母细胞瘤的生长和肿瘤血管生成产生影响,目前国内外尚未见相关报道。本研究拟以EED为干预物质,观察其对人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞、人脐静脉血管内皮细胞体外增殖和SK-N-SH细胞移植瘤体内生长的影响;并检测细胞周期进展、细胞凋亡和肿瘤血管的生成,以探讨EED促神经母细胞瘤生长可能的作用途径。本实验将揭示EED对神经母细胞瘤潜在的致癌作用,从而为儿童肿瘤的预防、治疗和强化环境保护措施的制定提供可靠的科学理论依据。材料与方法:(一)人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞体外增殖实验:SK-N-SH细胞经常规培养扩增后分为7组:组1,无干预(对照组);组2,加17β-雌二醇(E2);组3,加双酚A(BPA);组4,加玉米赤酶烯酮(ZEA);组5,同时加E2和ICI 182,780;组6,同时加BPA和ICI 182,780;组7,同时加ZEA和ICI 182,780。分别在0、24、48和72 h检测细胞光吸收度值(AV),72 h用流式细胞仪检测DNA增殖指数(PI)及细胞凋亡指数(AI)。并在72 h采用脱氧核糖核苷酸木端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)观察细胞凋亡情况,用免疫组化及Western Blot分析法检测细胞周期蛋白CyclinD1、CDK4、p21及PCNA的蛋白表达。(二)人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)体外增殖实验:HUVEC经常规培养扩增后分为11组:组1,无干预(对照组);组2,加17β-雌二醇(E2);组3,加双酚A(BPA);组4,加玉米赤酶烯酮(ZEA);组5,加壬基酚(NP);组6,加邻苯二甲酸-2-乙基己酯(DEHP);组7,同时加E2和ICI 182,780;组8,同时加BPA和ICI 182,780;组9,同时加ZEA和ICI 182,780;组10,同时加NP和ICI 182,780;组11,同时加DEHP和ICI 182,780。分别在0、24、48和72 h检测光吸收度值(AV),72 h流式细胞仪检测DNA增殖指数(PI)及细胞凋亡指数(AI)。72 h用TUNEL观察细胞凋亡情况,同时采用免疫组化及Western Blot分析法检测CyclinD1、CDK4、p21及PCNA的表达。(三)移植瘤体内生长实验:BALB/C雌性裸小鼠40只,1×10~7/0.2ml的SK-N-SH细胞接种于皮下,可触摸到肿瘤结节时,随机分为四组:组1,假手术组(SHAM);组2,卵巢切除(OVX)为对照组;组3,OVX+E2(E2);组4,OVX+BPA(BPA)。每周测两次肿瘤体积,第18天处死裸鼠,测量瘤重,运用免疫组化、Western Blot法检测CyclinD1、CDK4、p21、PCNA和血管内皮细胞生长因子、Ⅷ因子相关抗原等的表达,并计算微血管密度,用流式细胞仪检测肿瘤细胞的DNA增殖指数(PI)。结果:(一)SK-N-SH细胞体外增殖实验:SK-N-SH经各种物质干预后,各时点的AV均有增加。72 h时,组3、4的AV值分别为1.02±0.11、1.05±0.04,是对照组(0.86±0.25)的1.19~1.22倍(p<0.05);组3、4的P1分别为25.57±1.89%、25.70±0.60%,较对照组(17.96±1.31%)分别提高42.4%和43.1%(p<0.01),组2的AV和PI与组3、4结果相似(p>0.05);72 h时,组5、6、7的AV和PI明显低于组2、3、4(p<0.01)。72 h时,对照组及组5、6、7中均出现明显的亚二倍体峰,组2、3、4峰值较小,E2、BPA、ZEA组的AI值分别为6.31±1.42%、7.41±2.34%、8.08±1.23%,明显低于对照组(35.75±15.90%,p<0.05)。用TUNEL方法检测结果与之相似;免疫组化和Western Blot检测发现组2、3、4中CyclinD1、CDK4及PCNA的表达明显高于对照组和5、6、7组(p<0.05),p21在各组之间没有统计学性差异(p>0.05)。(二)HUVEC体外增殖实验:E2、BPA、ZEA、DEHP组中的AV在24、48、72 h均明显增加。72 h时,对照组、BPA、ZEA、NP、DEHP组的AV分别为0.56±0.12、0.76±0.04、0.74±0.07、0.90±0.15、1.00±0.04。4种物质组的AV约是对照组的1.3~1.7倍(p<0.05)。72 h,以上5组的PI分别为30.86±7.08%、44.81±4.29%、44.21±2.60%、44.13±3.06%、44.67±3.41%。BPA、ZEA、DEHP组的尸哟是对照组1.5倍(p<0.05),加入ICI 182,780后,细胞增殖受到明显抑制。72 h时,对照组及加入ICI 182,780组中出现明显的亚二倍体峰,E2、BPA、ZEA、NP、DEHP组峰值较小,AI分别为8.25±3.32%、10.59±4.92%、9.81±4.60%、10.65±3.63%、9.83±5.29%,较对照组(45.16±11.50%)明显降低(p<0.05)。用TUNEL法检测结果与之相似;免疫组化和Western Blot检测发现组2、3、4中CyclinD1、CDK4及PCNA的表达明显高于对照组和5、6、7组(p<0.05),p21在各组之间没有统计学性差异(p>0.05)。(三)移植瘤体内生长实验:BPA、E2、SHAM组的移植瘤生长较对照组快,BPA组肿瘤体积较对照组提高59%(p<0.05),肿瘤重量较对照组增高82%(p<0.05),瘤体内细胞PI提高19%(p<0.05),微血管密度提高83%(p<0.01),VEGF蛋白表达增高54%(p<0.05)。此外,CyclinD1、增殖细胞核抗原的表达均较对照组明显增高(p<0.05),但CDK4、p21在各组中免疫染色为弱阳性或无着色,Western Blot分析显示两者在各组间没有显著性差异(p>0.05)。E2、SHAM组的结果与BPA组相似。结论:1.环境内分泌干扰物双酚A、玉米赤酶烯酮可促进神经母细胞瘤SK-N-SH细胞的体外增殖。雌激素受体通路、细胞凋亡抑制和细胞周期进展可能参与了该促增殖作用。2.双酚A、玉米赤酶烯酮可促进人脐静脉血管内皮细胞的体外增殖。雌激素受体通路、细胞凋亡抑制和细胞周期进展可能参与了该促增殖作用。3.壬基酚、邻苯二甲酸-2-乙基己酯促进人脐静脉血管内皮细胞的体外增殖,及其具体作用途径不确定,有待进一步研究。4.双酚A可促进人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系裸鼠移植瘤的生长。5.细胞周期进展、肿瘤血管生成可能参与了双酚A、雌二醇促人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系裸鼠移植瘤体内生长的作用。……   
[关键词]:神经母细胞瘤;雌激素;环境内分泌干扰物;细胞周期;细胞凋亡;血管形成
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:复旦大学2006年