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肝炎病毒(HBV、HCV)基因诊断芯片的研制和新型肝炎病毒SENV的实验研究

高英堂

   HBV和HCV是临床上最常见、危害最大的两种肝炎病毒,其长期持续的慢性感染与肝硬化、肝癌的发生发展密切相关。随着人们对肝炎病毒认识的不断深入,尤其是肝炎病毒基因组学研究的进展,使临床上现有的血清免疫学方法和以单一PCR技术为主的检测方法其局限性越来越明显,由于不能真实、全面地反映患者体内病毒基因组的各种变异和动态变化,对患者个体的针对性诊断和治疗也受到很大限制。为及时将肝炎病毒的基因研究成果应用于临床实践,需要利用新的分子生物医学技术,研究和开发肝炎病毒的新型诊断方法和诊断试剂。据此,我们重点研究了HBV和HCV基因诊断芯片的制备、应用,以及新型肝炎病毒SENV的实验研究。 本文涉及的实验方法包括生物信息学分析(即芯片上探针和PCR引物的设计、测序序列的检索和比对)、探针和PCR引物的合成、PCR产物直接测序、基因芯片上探针的点样制备方法、血清中病毒的提取方法、PCR扩增和地高辛标记、分子杂交及显色、芯片杂交结果的数据处理等。芯片制备过程中的优化环节包括:尼龙膜型号和探针固定照射剂量的选择,探针3′末端加尾碱基数的确定,利用探针的互补寡核苷酸序列和部分PCR产物的测序验证芯片杂交的特异性,利用PCR扩增直接参入地高辛信号分子,分析其长度、浓度及杂交时间对杂交信号的影响,比较了HBV标本的不同处理方法和不同PCR引物组合的扩增效率。经过二年多的反复实验研究,初步完成HBV基因芯片、HCV基因芯片和HBV、HCV联检芯片的制备。 在HBV基因芯片的研制过程中,先后制备了HBV-450S、HBV-90S、HBV-120S、HBV-P/S区75S和HBV-C/X区25S等不同点阵数的基因芯片。最早的HBV-450S芯片包含的基因信息最丰富,理论上可检测HBV的7种基因型、4种血清亚型、4个P基因耐药相关的突变位点、2个S抗原突变位点、6个C区变异和X区的缺失突变,但部分探针特异性较差。在随后的改进中,HBV-P/S区75S是目前临床实验研究较好的芯片,对基因型、血清亚型和拉米夫定耐药突变均能特异检测。同时,利用制备的HBV基因芯片,对45例纳入葛兰素威康公司评价新药拉米夫定疗效临床研究的乙肝患者、270例三中心医院的门诊慢性乙型肝炎患者和466例来自6个……   
[关键词]:基因芯片;乙型肝炎病毒;丙型肝炎病毒;聚合酶链反应;SEN病毒
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:南开大学2003年