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嗅鞘细胞联合神经干细胞脑内移植治疗帕金森病的实验研究

李升

   目的探讨嗅鞘细胞(OECs)联合神经干细胞(NSCs)脑内移植对NSCs增殖、分化及对PD大鼠的治疗作用。方法1、NSCs培养:取E14.5 d SD大鼠腹侧中脑组织制备成单细胞悬液,接种到含有表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF ),碱性成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor-basic,bFGF、)B27(B27 suplement)的DMEM/F12(1:1)的无血清培养液中培养,待形成原代克隆球后,用有限稀释法进行单细胞克隆和传代扩增,以获得大量来源相同的NSCs克隆球,并进行Brdu和Nestin免疫细胞化学检测。2、OECs培养:取E14.5 d SD大鼠两侧嗅球组织制备成细胞悬液,离心后去上清,将细胞浓度调整到1×106个/ ml,移至含20%胎牛血清OECs培养液培养。3、将培养传至第三代的OECs与NSCs共培养。用P75免疫组化法,P75/Nestin, P75 ,Brdu/Nestin ,GFAP,NF,NF/TH免疫荧光法分别鉴定OECs和NSCs的增殖与分化。4、立体定位下,于左侧黑质致密部(SNC)和腹侧被盖(VTA)注射6-OHDA制备PD大鼠模型。将成功PD大鼠模型随机分成5组,即假手术对照组(注入生理盐水);NSCs移植组;OECs移植组;OECs+NSCs移植组和模型对照组。5、将上述培养传代至第3代的NSCs、OECs和OECs+NSCs,浓度为1.0x106细胞/μl,分别移植到PD大鼠吻侧纹状体内,于移植后7 d、14 d、30 d、60 d检测PD大鼠旋转行为变化后,深麻下处死,灌流固定取脑做冰冻切片,行HE染色和Brdu,TH,P75, Brdu/TH, Brdu/P75免疫组化和免疫荧光染色。结果1、OECs在培养7 d时,绝大多数呈梭形且发出2至3个突起,少量呈扁平椭圆形,免疫组化呈P75阳性反应。2、NSCs培养7 d时,显示典型的神经球悬浮生长,呈Brdu/Nestin免疫荧光双标阳性;10 d后细胞活性下降,球体积不再增大,球中心透亮度明显下降;14 d后偶见神经球贴壁分化,GFAP和NF免疫荧光检测显示,大部分为红色荧光标记的GFAP+细胞,少数为绿色荧光标记的NF+细胞。3、OECs+NSCs共培养组在5 d时形成神经球;10 d时球体积不断增大,球中心透亮度良好;12 d后神经球的体积不再增大,开始贴附在OECs上生长,可见神经球向四周伸出突起并开始分化;14 d时紧贴OECs生长的NSCs,同OECs广泛交织在一起,P75/Nestin免疫荧光染色可见红色荧光Nestin标记的NSCs,绿色荧光P75标记的OECs; GFAP和NF免疫荧光染色显示,大部分为绿色荧光标记的NF+细胞,小部分为红色荧光标记的GFAP+细胞。OECs+NSCs共培养组和NSCs单独培养组NF阳性细胞率分别为69.5%,47.2%,前者明显高于后者(P < 0.05);其中向TH分化的比例,共培养组是36.7%,而NSCs单独培养组仅6.34%(P < 0.05)。4、细胞移植后第1周,各组大鼠的旋转行为无明显变化;第30天和60天时,与假手术组和模型对照组比较,旋转行为有较为明显的改善(P < 0.05),其中OECs+NSCs共移植组的旋转行为改善较单纯移植NSCs组和单纯移植OECs更为明显(P < 0.05)。5、HE染色显示,移植后一天,移植细胞呈簇状或串状沿针道分布,细胞数量较多。6、Brdu免疫荧光染色显示,移植区Brdu阳性细胞为FITC绿色荧光标记,大多数细胞较小,无突起,呈圆形或椭圆形,少数呈多边形或不规则形态。随着时间的推移,Brdu阳性细胞数量越来越少。7、TH免疫荧光显示,从第7天起,在移植区可见胞浆呈罗丹明红色荧光标记的TH阳性神经元(15-27个/视野),呈圆形或椭圆形,无明显突起,分布在针道与纹状体实质的交界处;在第30天,在针道的两侧TH阳性神经元增多(28-34个/视野),,有的可见少许突起。NSCs移植组和OECs移植组在移植区也可见少数罗丹明红色荧光标记的TH阳性神经元。经过图像处理和数据统计,OECs+NSCs移植组TH神经元阳性率高于NSCs、OECs单独移植组(P<0.05)结论1、从E14.5胚胎大鼠腹侧中脑组织可以分离得到具有不断增殖和自我更新能力的NSCs。2、在体外培养条件下,OECs有促进NSCs增殖和诱导其分化的作用,其中分化成神经元的比例高于星形胶质细胞,并有部分可以分化为TH阳性神经元。3、NSCs、OECs分别单独移植或OECs+NSCs联合移植入PD大鼠的纹状体内,对于PD大鼠的旋转行为均有改善,但联合移植优于单独移植。4、在体移植情况下,OECs能够诱导胚鼠中脑来源的NSCs向TH阳性神经元分化。5、OECs可供选择用于中枢神经系统损伤修复和再生的理想替代种子细胞,与NSCs联合移植效果更好。……   
[关键词]:嗅鞘细胞;神经干细胞;细胞培养;脑移植;免疫组织化学;免疫荧光;帕金森病;大鼠
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:东南大学2006年