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流行性乙型脑炎病毒E蛋白主要抗原域与猪IgG_1-Fc片段在大肠杆菌中的融合表达及其应用研究

魏建超

  流行性乙型脑炎(Epidemic Encephalitis B)是由日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus, JEV)引起的中枢神经系统的急性传染病。本病不但对养猪业造成了巨大的经济损失,而且在世界许多国家广泛存在,严重威胁着人类的健康。乙脑的诊断可以通过临床检测结合流行病学进行,确诊需要实验室血清学检测和病原学检测。目前,乙脑的治疗没有有效的方法,只有进行疫苗接种结合灭蚊工作进行。本文利用E. coli原核表达系统对JEV主要结构基因E蛋白基因和猪IgG_1-Fc片段基因在大肠杆菌中进行了融合表达,并利用表达产物初步建立了检测JEV抗体的新型SPA协同凝集试验,同时免疫BALB/c小鼠,评价融合蛋白E-pFc诱导BALB/c小鼠产生抗JEV特异性免疫效果。这为新型流行性乙型脑炎的血清诊断方法的建立和新型疫苗的研制奠定了基础。研究结果如下:1.根据GenBank公布的猪IgG_1的核苷酸序列,设计一对引物,克隆猪IgG_1-Fc域中包含部分CH2和完整CH3片段的基因。测序结果表明,RT-PCR产物大小为469bp,该片段的核苷酸序列与GenBank收录的猪IgG_1的核苷酸序列同源性为99.2%,与猪IgG_(2a)、IgG_(2b)、IgG_3、IgG_4核苷酸序列同源性分别为89.7%、89.7%、96.7%以及91.4%。从遗传进化树中可以看出,扩增片段与猪IgG_1的遗传距离最近,在同一分支上。这说明我扩增的序列是猪IgG_1亚型的。2.该片段编码的氨基酸序列的长度为120,与猪源IgG氨基酸序列同源性较高,为79.2%~98.3%,与其它动物IgG氨基酸序列同源性低于68.3%。从推导的氨基酸序列可以看出,该片段中含有两个半胱氨酸Cys38和Cys98,这与设计一致。3.通过Linker连接到表达载体pET-E中E基因的下游,即构建成了重组表达质粒pET-E-pFc,用酶切鉴定插入目的基因的正确性。将其转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达和超声波裂解菌体后,运用SDS-PAGE进行可溶性分析,然后以His·Bind螯合层析柱和SPA亲和层析柱两种方法纯化融合蛋白,SDS-PAGE、薄层凝胶扫描、Western Blotting和iELISA对该融合蛋白进行了鉴定,并分析了两种亲和层析方法的纯化效果。结果显示,重组融合蛋白以包涵体的形式获得了高效表达,其表达量达27.5%,上述两种层析方法纯化的融合蛋白E-pFc达到了较高的纯度,其纯度达96%,且证实了重组融合蛋白具有良好的抗原性和与SPA结合的特性,但变性的……   
[关键词]:乙脑病毒;E蛋白主要抗原片段;猪IgG_1-Fc片段;SPA协同凝集试验;细胞免疫;体液免疫
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2006年