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农杆菌介导AtNHX1基因转化葡萄砧木99R的研究

庄智敏

  本研究以葡萄砧木99R(Vitis berlandieri Planch×V.rupestris Scheele’99R’)为材料,建立其分化频率较高,培养方法简单的再生体系,为葡萄遗传转化研究打下基础。采用农杆菌介导法,将Na~+/H~+反向转运蛋白AtNHX1基因导入葡萄砧木99R中,以获得耐盐碱的砧木品种。本研究系统地探讨了提高葡萄再生和遗传转化效率的影响因子,优化了农杆菌介导法转化葡萄的主要技术参数,建立起高效的遗传转化体系。研究结果如下:1.以葡萄砧木99R试管苗叶片、叶柄和茎段为外植体诱导不定芽再生。在MS培养基中附加不同浓度的6-BA与IBA、TDZ与IBA、6-BA与2,4-D组合。结果表明,叶片和叶柄适宜的再生培养基为MS+BA5.0mg·L~(-1)+IBA0.1mg·L~(-1),再生率分别为40.54%和50.00%,茎段为MS+BA2.0mg·L~(-1)+IBA0.02mg·L~(-1),再生率达62.50%。TDZ与IBA组合对葡萄砧木99R不定芽的诱导效果较差,再生率最高的也只有7.69%。6-BA和2,4-D组合以MS+BA8mg·L~(-1)+2,4-D0.05mg·L~(-1)下再生率最高,叶柄达42.11%。一定时间的暗培养处理利于葡萄砧木99R不定芽的再生,3周为最适宜的暗培养时间。不同节位外植体不定芽再生率随叶片节位的下降而降低。2.以葡萄砧木99R的叶片、叶柄及茎段为农杆菌介导转化受体,通过对GUS基因的瞬时表达率的分析,研究此转化体系的最佳实验参数。实验表明,侵染4分钟、共培养2天、Km3.0mg·L~(-1),添加AS75mg·L~(-1)和Cef250mg·L~(-1)时,GUS的瞬时表达率最高。在MS+BA5.0mg·L~(-1)+IBA0.1mg·L~(-1)+Cef250mg·L~(-1)+Km3.0mg·L~(-1)培养基上继代筛选获得抗性芽。3.用优化的农杆菌介导法对葡萄砧木99R的2546个外植体转化AtNHX1基因,获得25株抗性苗,转化率为0.98%,对获得的抗性苗进行GUS检测,初步证实其中1株AtNHX1基因可能已经整合到葡萄砧木99R的基因组中,阳性表达率为4%。……   
[关键词]:葡萄砧木99R;再生;农杆菌介导;遗传转化;AtNHX1基因
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:南京农业大学2006年