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核盘菌致病力衰退相关真菌病毒(SsDRV)全长cDNA克隆及侵染性cDNA转化载体的构建

谢俊

  真菌病毒普遍存在于各类真菌中,因其很少使寄主出现异常表型而难以引起人们的关注。植物病原真菌内存在一些可导致病原寄主出现病毒性致病力衰退的真菌病毒,并被成功应用于植物病害的生物防治,但病原寄主种内复杂的营养体不亲和性限制了病毒的传播扩散,随之影响到致病力衰退相关病毒的控病效果和应用范围。核盘菌是一种重要的植物病原真菌,由核盘菌引起的菌核病是世界性分布的重要病害。菌核病因缺乏野生抗性资源、自然寄主广泛、病原菌自身抗药性等原因,在防治上一直存在极大的困难。本论文以分离自佳木斯发病茄子植株上的核盘菌弱毒菌株Ep-1PN为材料,对核盘菌Ep-1PN中致病力衰退相关RNA病毒(SsDRV)进行了以下一些研究,尝试将其应用于菌核病的生物防治:采用RT-PCR及RACE克隆技术对从核盘菌弱毒菌株Ep-1PN中提取的5.4kbdsRNA片段进行了全长cDNA测序,得到了全部5470个核苷酸序列,并已在GenBank登录注册(登录号为AY147260)。序列分析表明,SsDRV只有一个开放式阅读框(nt 93-5195),推定的氨基酸序列包含许多正链RNA病毒复制酶系中典型的甲基转移酶、解螺旋酶和依赖RNA的RNA聚合酶(RdRp)保守区域;序列同源性比较发现SsDRV与植物上的Flexiviridae科allexivirus属病毒以及一种未分类的侵染植物病原菌灰葡萄孢(Botrytis cinerea)的真菌病毒Botrytis virus F(BVF)有较高的同源性,但SsDRV因其缺乏外壳蛋白和运动蛋白而有别于allexivirus属植物病毒和BVF。在SsDRV序列中部确定一个单一酶切位点ClaⅠ(nt 2338),从位点的上游和下游分别设计引物与对应的SsDRV末端序列以SsDRV核酸反转录产物为模板,PCR扩增3’端和5’端包含ClaⅠ酶切位点的片段,分别连接到pMD18-T载体上获得亚克隆。选用T载体上的酶切位点SacⅠ与SsDRV序列上的酶切位点ClaⅠ双酶切两端序列的亚克隆,回收带有SsDRV序列的cDNA的片断,连接后得到T载体上的SsDRV全长cDNA克隆。在获得的SsDRV全长cDNA前转载来自构巢曲霉的trpC启动子后,连同trpC酶切后连接到用于转化植物的pCAMBIA1301载体上,同时用另一个trpC启动子替换pCAMBIA1301中原有的用于启动潮霉素抗性基因的CaMV 35S启动子,获得用于转化丝状真菌的SsDRV全长侵染性cDNA转化载体。将构建好的载体通过热击转化导入农杆菌EHA105菌株,通过农杆菌介导转化核盘菌的重寄生真菌盾壳霉。本研究的目的是尝试一种利用核盘菌致病力衰退相关真菌病毒来控制菌核病的可能途径,即由核盘菌重寄生真菌盾壳霉的寄生作用来打破核盘菌株系间菌丝亲和……   
[关键词]:真菌病毒;弱毒病毒;SsDRV;侵染性cDNA;真菌转化;核盘菌;生物防治
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2006年