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土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白基因的克隆和磷酸丙糖异构酶基因的克隆及表达

魏佳

  东毕吸虫病是由分体科东毕属的各种吸虫寄生于牛、羊等哺乳动物的门静脉和肠系膜静脉而引起的一种血吸虫病。该病在我国分布极其广泛,给畜牧业带来极大经济损失。同时东毕吸虫的尾蚴可使人患尾蚴性皮炎,也称稻田皮炎,严重影响人类的身体健康,是一种非常重要的人畜共患寄生虫病。目前对东毕吸虫病的防制还存在诸多困难,首先,实践证明通过杀灭血吸虫的中间宿主——螺类来防治血吸虫感染的效果是不明显的;其次,通过吡喹酮治疗血吸虫病虽然效果很好,但也存在治疗费用高、不能防止重复感染以及耐药性的产生等缺点,现普遍认为有必要研究血吸虫的疫苗来预防此病。本研究克隆了土耳其斯坦东毕吸虫肌动蛋白基因(ACTIN)和磷酸丙糖异构酶基因(TPI)的全长序列,并将磷酸丙糖异构酶基因在毕赤酵母中高效表达。首先,根据日本血吸虫和曼氏血吸虫肌动蛋白基因和磷酸丙糖异构酶基因核苷酸序列的保守区设计引物,利用RT-PCR从土耳其斯坦东毕吸虫成虫总RNA分别扩增ACTIN和TPI的中间大片段,再根据已知序列利用5RACE和3RACE技术分别扩增出ACTIN和TPI的5’和3’端,将三段序列拼接得到ACTIN和TPI的全长cDNA序列并登录GeneBank,登录号为:ACTIN为DQ017265,TPI为DQ092331。其次,根据TPI全长cDNA序列设计两条加有EcoR I和Not I酶切位点的引物,利用RT-PCR扩增TPI全长序列并克隆到pMD18-T载体,EcoR I和Not I双酶切重组载体pMD18-T/TPI后将获得的全长TPI亚克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k构成重组表达载体pPIC9k/TPI,Sal I酶切重组表达载体pPIC9k/TPI后电击转化到酵母菌株GS115感受态细胞中,用组氨酸缺陷培养基和G418依次筛选多拷贝质粒整合的毕赤酵母菌株。重组酵母细胞在含甲醇的培养基中分泌表达目的蛋白,培养3d后收取上清,SDS-PAGE显示表达的蛋白分子量为43kDa,进行westernblot分析结果表明该蛋白被自然感染东毕吸虫的绵羊血清所识别。蛋白表达时相分析表明,甲醇诱导72h蛋白表达产量最高。表达产物通过葡聚糖凝胶G-75层析柱纯化,测定蛋白浓度为1200mg/L。最后,用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔,ELISA分析结果表明:空白组的抗体水平一直处于平稳的状态,而免疫组在免疫后抗体水平呈现不断上升的趋势,一次免疫组和加强免疫组的抗体水平均在第四周达到峰值,但加强免疫组较一次免疫组的免疫效果好。由此可见,TPI蛋白具有一定的免疫原性,可以作为东毕吸虫疫苗的候选基因。……   
[关键词]:土耳其斯坦东毕吸虫;肌动蛋白;磷酸丙糖异构酶;基因克隆;毕赤酵母;表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:华中农业大学2006年
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