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柑橘黄龙病菌及与其混合发生病毒的分子特性及超低温脱除研究

丁芳

  柑橘黄龙病(Citrus Huanglongbing,HLB)是世界性柑橘生产上的毁灭性病害。易与其混合发生的几种柑橘病毒病及类似病害主要包括衰退病、裂皮病和碎叶病;病原分别为Citrus tristeza virus(CTV),Citrus exocortis viroid(CEVd),Citrus tatter leaf virus(CTLV)。本研究主要以HLB病菌、CTV、CEVd、CTLV为对象,从生物学角度及分子水平上对其部分特性进行研究;目的是建立上述4种病原的高灵敏度的分子检测技术体系;在分子水平上明确其部分分子特性。另外初步探讨运用超低温技术脱除HLB病菌、CTV、CEVd的可能性及机理。主要获得结果如下:1.HLB病菌生物学鉴定及PCR检测体系优化。以长春花和椪柑为指示植物,部分待检材料表现了明显HLB症状。通过对影响PCR技术的各个主要因素的调整,建立了HLB病菌PCR、Semi-Nested PCR及Nested-PCR检测技术;并对三种方法的检测灵敏度进行比较,结果发现Semi-Nested PCR及Nested-PCR检测灵敏度远高于常规PCR,是常规PCR的10~4倍。运用Nested-PCR技术在黄皮上检测出HLB病菌(Candidatus Liberobacter asiaticus),在国内外属于首次报道。2.不同引物检测HLB病菌灵敏度比较。对基于rplA/rplK,β-operon,16SrDNA和16S/23SrDNA不同基因组序列设计的5对引物依次为fP400/rP400,fP535/rP535,fA2/rJ5,fOI1/rOI2c,fOI2/r23S1检测HLB病菌灵敏度进行了比较,结果发现不同引物检测灵敏度不一样,其检测灵敏度由高到低依次为:fP400/rP400>fP535/rP535>fA2/rJ5>fOI1/rOI2c>fOI2/r23S1。3.HLB菌亚洲株系分子鉴定。HLB病菌16SrDNA片段RFLP-SSCP分析及基于16SrDNA序列中国柑橘黄龙病菌属分类地位的确立,分析结果显示来自中国7省区9个代表性的分离物16SrDNA高度保守,全部属于亚洲菌系(Candidatus Liberobacter asiaticus)。HLB病菌16S/23SrDNA间区序列分析及系统进化树分析结果显示:来自中国7省区分布在不同的寄主体内、导致寄主表现不同症状的18个分离物在该区段没有发生显著变异,各分离物之间的同源性达99%以上,全部与亚洲菌系(Candidatus Liberobacter asiaticus)高度同源,而与非洲菌系(Candidatus Liberobacter africanum)差异较大。4.HLB病菌Southern blotting检测。利用α-~(32)P-dCTP标记16SrDNA探针进行HLB病菌Dot-blotting检测,结果发现Dot-blotting检测灵敏度高于常规PCR而低于Semi-Nested PCR及Nested-PCR,最低检测下限为30fg总核酸。5.CTV生物学鉴定、RT-PCR检测技术的建立及来自不同寄主的21个分离物3 端、5 端分子特性分析。以墨西哥莱檬和甜橙为指示植物,待检样品表现典型的CTV致病症状。核苷酸序列多重比对分析结果显示:21个CTV分离物的5 端和3 端共4个变异区(A区,F区,CP,P20)存在明显的差异。A区的核苷酸序列……   
[关键词]:柑橘;黄龙病菌;衰退病毒;裂皮病类病毒;碎叶病病毒;检测;分子特性;超低温;机理
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2006年