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柑橘速衰病毒的遗传多样性研究

张建坤

  由柑橘速衰病毒(Citrus tristeza virus,CTV)引发的柑桔速衰病是全世界柑桔生产中破坏力最强、经济意义最为重要的病害之一。它主要危害以酸橙作砧木的柑桔,也能引起葡萄柚和某些甜橙品种的茎陷和果实变小等症状。本研究应用RT-PCR、单链构象多态性(Single-strand conformation polymorphism,SSCP)、DNA测序和系统发育分析等方法,目的是要调查我国柑橘CTV感染的基本情况,比较不同分离物的序列特征,探索CTV的系统进化关系,最终为开发分子标记鉴定我国CTV株系提供理论指导。结果如下:1.以随机采样的方式,从湖北、湖南和江西3省10县的柑橘产区收集242份温州蜜柑(Citrus unshiu Marc.)、橘(C.reticulata Blanc.)、甜橙(C.sinensis Osb.))和柚(C.grandis Osb.)样品。对PAS-ELISA法检测呈阳性的样品进行CTV的CP(Coating protein,CP)基因的RT-PCR扩增,结果来自14个样品采集地的120份样品感染了CTV,单个采样点的感染率为20.0%-71.4%,总感染率达49.6%,表明CTV在这些地区已经广泛分布。SSCP分析显示,120份CP基因的RT-PCR扩增产物共产生120种SSCP谱型,每一种谱型含有2-7条不等的单链DNA带,暗示这些样品采集地区存在广泛的CTV混合感染。以CTAB-LiCl法制备的总RNA为模板,可以对柑橘进行CTV的RT-PCR检测。该法制备总RNA的过程简单,成本低廉。2.以柑橘叶片总RNA为模板,用RT-PCR扩增CP基因,扩增产物经克隆与测序证实,来自湖南道县和江西崇义3份橘的实牛苗样品(HN、JX-1和JX-2)都感染了CTV。通过扩增产物克隆前和克隆后的PCR-SSCP分析,发现来自HN和JX-1的CP基因各自只含有1种独特的序列,来自JX-2的序列则含有2种主要的序列。这表明来自3份样品的CTV的CP基因不仅存在序列变异,而且样品JX-2的CTV群体可能因为混合感染而呈异质性。通过双向测序和序列分析,4个CP基因序列都没有碱基插入、缺失或终止密码子插入,含有完整的翻译区。核苷酸序列比对分析表明,4个克隆之间的相似性为93%-98%;克隆HN-K与葡萄牙分离物28C、以色列茎陷分离物VT的相似性都达到98%;克隆JX-1-1与印度茎馅分离物Pune和Bangalore的相似性都在98%以上;克隆JX-2-7、JX-2-17与日本苗黄分离物NUagA和美国加利福尼亚严重茎陷分离物SY568的相似性也在97%-98%之间。4个克隆与佛罗里达速衰分离物T36、弱毒分离物T30和西班牙弱毒分离物T385的相似性仅有91%-93%。系统树分析显示,4个中国克隆分属3个不同的分支,每个分支由中国克隆和地理来源不同的茎陷或苗黄分离物组成。3.以SSCP分析显示CTV混合感染程度较轻的江西省于都县的1份甜橙样品为材……   
[关键词]:柑橘速衰病毒;CP基因;p23基因;RdRp基因;单链构象多态性;分子变异性;混合感染;系统发育分析;分子标记;株系鉴定
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:华中农业大学2006年