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α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆表达

李联正

  α-乙酰乳酸脱羧酶(ALDC,EC4.1.1.5)可以转化双乙酰的前体α-乙酰乳酸为乙偶姻而不影响啤酒风味。双乙酰是啤酒发酵代谢中的一种不良风味物质。由于降低双乙酰是啤酒成熟过程中最费时的步骤,所以加速该步骤对于啤酒酿造工业具有重要的意义。本研究包括枯草芽孢杆菌α-乙酰乳酸脱羧酶基因的分离和在大肠杆菌中的表达;利用大肠杆菌稀有密码子的转移RNA提高α-乙酰乳酸脱羧酶表达水平及表达活性的尝试;α-乙酰乳酸脱羧酶在毕赤酵母中分泌表达;含有ALDC基因重组啤酒酵母的构建几个部分。PCR扩增出枯草杆菌168α-乙酰乳酸脱羧酶基因,分别克隆到大肠杆菌质粒pUC18和pQE60中,构建了重组质粒pUC18-ALDC和pQE60-ALDC。序列测定结果表明编码α-乙酰乳酸脱羧酶的全长基因插入了载体pUC18;在T5启动子下,经IPTG诱导α-乙酰乳酸脱羧酶基因得到了表达,进行ALDC定性和定量测定,酶活力为0.11U/mL。为了促进α-乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中的表达,分别构建了pOK12-argU和pOK12-ileX两个重组质粒。pOK12-argU含有argU基因可以转录出精氨酸的转移RNA(tRNA~(Arg));pOK12-ileX含有ileX基因可以转录出异亮氨酸的转移RNA(tRNA~(ileX))两个质粒分别和重组质粒pQE60-ALDC在大肠杆菌TOP10中共表达,通过活性测定和SDS-PAGE分析,结果表明表达水平得到提高。将ALDC基因克隆到了大肠—酵母穿梭质粒pPIC9中,得到的重组质粒电击转化导入巴斯德毕赤酵母GS115株中,α-乙酰乳酸脱羧酶基因基因整合到了毕赤酵母染色体上,得到可以稳定表达该基因的工程酵母菌株。在甲醇的诱导下,可以分泌表达出有α-乙酰乳酸脱羧酶活性的蛋白产物。SDS-PAGE分析可见到约62kDa的表达条带,活力测定为0.03U/mL。将α-乙酰乳酸脱羧酶基因克隆大肠—酵母穿梭质粒pYES2中,电击转化啤酒酵母实验菌株INVSc1,得到了可以降低双乙酰的工程菌株。……   
[关键词]:α-乙酰乳酸脱羧酶;枯草芽孢杆菌;双乙酰;克隆表达;活性测定
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2005年