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枯草芽孢杆菌Tat分泌表达青霉素G酰化酶初步研究

祝发明

   青霉素G酰化酶(Penicillin G Acylase,EC.3.5.1.11,简称PGA)是β-内酰胺类抗生素工业中最为关键的酶。提高PGA的生物合成活力将促进β-内酰胺类抗生素的酶法高效生产。目前大多数的蛋白都以包涵体的形式在胞质中生成,由于这种方法生成的蛋白存在复性困难这一问题,所以人们将目光移向原核生物的分泌表达。将外源蛋白的基因置于原核蛋白信号肽序列的下游有可能实现有效分泌表达,在穿膜的过程中,信号肽被信号肽酶切除,分泌表达的蛋白质和天然的产物是一致的。Bacillus subtilis是很有潜力的分泌型基因工程宿主菌, Bacillus subtilis分泌表达蛋白质主要有两种途径,一种是Sec(Sec-dependent translocation)途径,一种是Tat(twin-arginine translocation)途径。Sec途径主要有两个瓶颈:一是不能转移在细胞质中已折叠好的蛋白质,另一个是外源蛋白转移到膜外后折叠缓慢且来不及折叠就会被蛋白酶降解。而Tat途径的功能是转运那些折叠迅速或紧密的蛋白质甚至是多亚基酶复合物,这些蛋白无法通过Sec途径分泌。本研究利用基因工程和发酵工程技术,开展对枯草芽孢杆菌Tat分泌表达青霉素G酰化酶初步研究,获得以下结果: 1.构建了Tat信号肽检测载体。克隆了来源于Bacillus megaterium(ATCC14945)的pga基因(Genbank登录号BMU07682)。利用枯草芽孢杆菌的强启动子P43基因以及720bp的GFP基因片断构建了Tat信号肽检测载体pYGGFP。克隆枯草芽孢杆菌蔗糖-6-果糖转移酶信号肽SacB基因替换720bp的GFP基因,构建的表达载体转化WB700进行表达,验证信号肽检测载体的有效性。试验结果表明SacB信号肽成功引导PGA胞外分泌,证明了Tat信号肽检测载体是有效的。 2.克隆了来源于Bacillus subtilis168基因组(Genbank登录号NC 000964)的24个Tat信号肽基因,构建了24个装有Tat信号肽的PGA表达载体,并进行分泌表达PGA的研究。通过NIPAB滤纸法测定菌落PGA酶活,筛选到了四个表达系统,分别是pYGAlbB、pYGYmzC、pYGAmyX、pYGLipA(分别克隆有信号肽AlbB、YmzC、AmyX、LipA),能够在WB700中分泌表达PGA,培养36h PGA酶活分别为0.21U·ml~(-1)、0.26 U·ml~(-1)、0.11 U·ml~(-1)、0.08 U·ml~(-1)。证明了合适的枯草芽孢杆菌Tat信号肽能够使Bacillus megateriumPGA在枯草芽孢杆菌中分泌表达。 3.构建了Pglv启动子调控的PGA大肠杆菌和枯草芽孢杆菌穿梭载体。PGA酶活测定结果表明Pglv启动子调控PGA表达的效果优于P43。说明了P43启动子构建的载……   
[关键词]:枯草芽孢杆菌;Tat途径;青霉素G酰化酶;信号肽;NIPAB
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2006年