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猪流行性腹泻病毒重组M蛋白的原核表达、纯化及鉴定

高慎阳

   M蛋白是猪流行性腹泻病毒(PEDV )的主要的结构蛋白,与Genbank上的其它毒株相比较发现M基因具有很高的保守性,所以重组M蛋白可作为理想的检测抗原用于临床PEDV感染的检测。本实验为使M蛋白在原核细胞中得以表达,对M基因设计了几个大小不同的片断,同时采用不同的载体系统,探索了M基因的表达效果,即将猪流行性腹泻病毒的M基因及编码M蛋白膜外区M基因片断(M’)分别亚克隆到原核表达载体pJLA605和pGEX-6p-1中,构建了重组质粒pJLA605-M、pGEX-6p-M-GST、pGEX-6p-M和pGEX-6p-M’,转化大肠杆菌后,探索了M蛋白在N端和C端不带有谷胱苷肽巯基转移酶(GST)、N端和C端均带有GST、只在N端带有GST以及只含有M蛋白的膜外区M’蛋白的表达情况。SDS-PAGE分析结果表明,N端和C端带有GST的pGEX-6p-M-GST和只含有膜外区M’基因的重组质粒pGEX-6p-M’获得了高效表达,其表达产物分别以融合蛋白GST-M和GST-M’形式存在,经AlpharImager2200软件分析,表达量分别为20%和45%。对重组融合的M’蛋白进行包涵体提取及凝胶过滤层析纯化,得到纯度达90%以上的重组蛋白。分别用抗CV777株PEDV M蛋白的单克隆抗体和纯化PEDV病毒粒子对重组M’蛋白及由其制备的多克隆抗血清进行了鉴定,Western blotting及ELISA检测结果均表明重组M’蛋白有很好免疫原性与反应原性,因此重组M’蛋白与天然PEDV M蛋白有相同的生物学活性。 总之,本实验报道了PEDV中国地方流行毒株LJB/03重组M蛋白的表达,同时采用不同的载体系统,探索了M基因表达效果,获得了完整M蛋白和M蛋白的膜外区,并对重组M’蛋白进行了初步纯化与鉴定,实验所得各种数据,为以后该蛋白体外表达、分离、纯化以及诊断试剂的研制提供了具有参考价值的资料,并为PEDV M蛋白的结构和功能研究奠定了重要的物质基础。……   
[关键词]:PEDV;重组M蛋白;原核表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:东北农业大学2006年