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猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗株基质膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白基因的研究

蔡家利

  本课题在猪繁殖和呼吸综合征(PRRS)弱毒疫苗株克隆和鉴定的基础上,着重进行了PRRS病毒膜(M)蛋白和核衣壳(N)蛋白基因的研究,主要包括以下几个方面:一、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)疫苗弱毒株的克隆与鉴定 将从美洲和欧洲引进的2个PRRSV疫苗株进行了培养复壮,探讨了2个疫苗株的生长特征。并对美洲弱毒株进行了克隆、筛选和鉴定。克隆毒株最适宜生长的是MARC145细胞系,毒价可达10~7TCID_(50)/ml,超薄切片电镜观察病毒子呈球形,大小50—60nm。同时探讨了PRRSV弱毒株的免疫特性。二、PRRSV弱毒株M和N基因的克隆与鉴定 以PRRSV美洲毒株MN基因序列为模板、设计的一对能够合成MN基因的引物。采用RT—PCR成功扩增出一约900bp MN基因片段,构建了2个重组质粒PBVMN和PB-SMN。经酶切和部份序列测定得到证实。三、PRRSV弱毒株M和N基因的序列分析 将MN基因的重组质粒PBSMN进行了完整的序列分析,阐明了PRRSV弱毒疫苗克隆株MN基因的分子特征。M和N基因分别位于ORF6和ORF7,以8bp重迭而相连,分别有一个起始密码子和终子密码子,N基因上游13个核苷酸有一前导序列基元的结合位点。与其它毒株比较,PRRSVMc与美洲毒株同源性较高(92—97%),与欧洲毒株同源性较低(60—67%)。M基因比N基因更保守。分析了常见的46种内切酶,发现在MN基因段有17个内切酶34个酶切位点。四、PRRSVMc MN基因的表达 将重组质粒PBVMN进行了温敏诱导。SDS—PAGE电泳发现有一个约34KD的表达蛋白带,约占整个菌体的12%,但此表达蛋白免疫原性较差,Western—blot分析未出现阳性反应。五、应用RT—PCR直接检测流产胎儿组织中的PRRSV,利用设计的能够扩增MN基因的引物和建立的RT—PCR方法,对可疑PRRSV感染的流产胎儿病理组织进行了检测,扩增出了与理论设计同样大小的cDNA片段。RT—PCR阳性标本通过病毒分离得到证实。……