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亲和层析法纯化磷酸激酶的研究

王玉姣

  磷酸激酶(kinase)是一类催化以ATP为供体的磷酸基转移反应的酶,它们在药物生产、临床应用以及抗癌药物的研究等方面都具有重要的意义。本文开展了采用亲和层析方法对己糖激酶(HK,EC 2.7.1.1)分离纯化工艺的研究,通过亲和层析剂制备工艺的确定和亲和柱层析法分离纯化工艺的优化,获到了一条较佳的磷酸激酶纯化工艺路线。结果表明,该磷酸激酶亲和层析剂的制备成本低,合成工艺简单,分离纯化工艺效果良好,克服了一般亲和层析剂制备过程中费时、有毒性等缺点,对制备大量高纯度的磷酸激酶具有良好的应用前景。啤酒酵母经过预处理,冻融法破碎细胞后得到酶粗提液,经硫酸铵分步盐析(30%~70%),酶粗提液中HK的比活提高了3.3倍,酶活回收率为70.9%。通过对配基、接臂、载体、活化方法等方面的选择,确定了以纸纤维为载体、环氧氯丙烷为活化剂、1,6-己二胺为间隔臂、ATP为配基制备磷酸激酶亲和层析剂的工艺过程。在此基础上对主要工艺参数进行优化,确定了最佳反应条件为:活化剂用量1ml/(g载体),接臂pH 6.0,再活化pH 6.0,偶联温度35℃,偶联初始ATP浓度4.0mmol/L,偶联pH 6.0,偶联时间4h。在该条件下得到配基(ATP)密……   
[关键词]:磷酸激酶;亲和层析;纯化工艺
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江工业大学2006年
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