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毛细管电泳—电化学发光检测用于生物分析的两个实例

袁吉培

  本论文第一章基于毛细管电泳—Ru(bpy)_3~(2+)电化学发光(CE-ECL)对酶催化反应产物脯氨酸的检测建立了脯氨酸肽酶(PLD,EC 3.4.13.9)活性测定的新方法。在最佳测定条件下(pH 7.5,30 mmol/L磷酸盐缓冲溶液,5.0 mmol/LRu(bpy)_3~(2+),工作电极电位1.3V,进样:10kV,10s)脯氨酸的检测限为12.2fmol(S/N=3),相当于1.22×10~(-8)U PLD催化1 min产生脯氨酸的量。实验对影响酶反应的因素如预孵育、底物和辅因子的浓度、体系的pH及反应时间进行了优化。PLD的优化的反应条件为:(1)预孵育:缓冲溶液为3.0×10~(-3)mol/L(pH 7.6)磷酸盐缓冲溶液5倍稀释的血浆在1.0×10~(-3) mol/L Mn~(2+)存在时预孵育24小时。(2)孵育:Mn~(2+)浓度为1.0×10~(-3) mol/L;甘氨酰脯氨酸浓度为0.01mol/L:37℃孵育30min。(3)终止反应:体系于80℃的水浴中加热10min。在最佳反应及检测条件下,方法的相对标准偏差(RSD)为3.47%(n=10),回收率在97.0%与106%之间;4个血浆样本和2个血清样本分别用CE-ECL法和Chinard法进行检测,所得结果基本一致。我们将此方法用于糖尿病患者PLD活性的研究。45例样本的平均值为888.18 U/L,标准偏差为211.48 U/L,45个样本服从正态分布。在无高甘油三酯症的38例样品中,PLD活性与血糖值呈显著正相关(r=0.495,p<0.002)。伴随有高甘油三酯症及无高甘油三酯症的糖尿病血清PLD活性均显著高于血糖正常组(p<0.05),这一结果揭示糖尿病患者胶原代谢可能加速,高甘油三酯水平可能是导致胶原代谢异常的另一个因素。第二章将CE-ECL检测脯氨酸肽酶的方法用于5种维生素和4种非甾体抗炎药对PLD活性影响的研究,其中维生素C和维生素B12在低浓度时可提高PLD活性,高浓度时抑制PLD活性;维生素B1和维生素H均降低了PLD的活性。维生素B6在很大程度上提高了PLD的活性。除阿司匹林可提高酶的活性外,其他三种药物对PLD均存在抑制作用。实验研究了维生素H和扑热息痛对PLD抑制的动力学机理。维生素H对PLD的半数抑制浓度IC_(50)……   
[关键词]:毛细管电泳;电化学发光;脯氨酸肽酶;糖尿病;药物
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山东大学2006年