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用于食品中鼠疫耶尔森菌的纳米胶体金快速检测技术研究

岳明祥

  本文是基于胶体金颗粒在碱性环境中带负电荷,能与蛋白质分子的正电荷基团,借静电引力而形成牢固结合的特性标记具有高度特异性的鼠疫荚膜F1多价抗体建立了纳米胶体金快速检测鼠疫耶尔森氏菌的方法。根据抗体胶体金与被检测物结合形成稳定的肉眼可见结合物在一定波长范围内具有最大吸收峰实现了胶体金的定量检测,主要研究内容如下:1 鼠疫菌诊断血清的制备及多价抗体的纯化。根据典型鼠疫菌在37℃富含血液的培养基中培养能产生大量的F1封套抗原的特性对典型鼠疫菌进行增菌,将获得的菌种免疫健康家兔,采血分离F1多价抗体。分离的血清在56℃30分钟灭能后测定其效价,与耐热及不耐热鼠疫菌体沉淀原作用为阴性或凝集效价不低于1:320(++)为合格,制备好的血清置2—10℃备用。抗体纯化方法采用硫酸铵盐析后透析至无铵离子为止,冷冻保存。2 冻干鼠疫菌F1抗原的制备。采用具有丰富荚膜抗原的鼠疫弱毒菌EV株用厚氏培养基大量增菌,于37℃培养收集菌体,用冷丙酮洗涤,置37℃自然干燥,除去剩余丙酮,用乳钵研磨成菌粉,硫酸铵纯化,用最适量的F1抗原溶液致敏经鞣酸处理的醛化绵羊红血球,与鼠疫菌诊断血清(1:320(++)以上)做间接血凝反应时,其效价应达到1:50000(++)以上,而与假结核、布氏菌、土拉伦菌血清等应为阴性反应,即得到纯化好的F1抗原,冻干保存。3 制备胶体金和胶体金探针。采用柠檬酸钠还原法,制得直径为10nm,大小均匀的胶体金颗粒。通过试验确定F1胶体金最适标记蛋白用量为12μg/ml,然后制备标记鼠疫F1抗体的胶体金探针,经透射电镜检测合格,4℃保存备用。4 斑点金免疫渗滤法检测鼠疫方法的建立。通过对倍比稀释的鼠疫F1抗原和典型的鼠疫EV_(76)菌株进行检测,DIGFA检测F1抗原的最低检出限为10ng/ml;对EV_(76)的最低检出限为2.4×10~5cfu;其特异性除4株鼠疫菌外,不与包括小肠结肠炎和假结核耶尔森菌等其它细菌发生交叉免疫反应;整个反应过程在10min内完成。5 斑点金—薄层色谱法检测鼠疫的实验研究。根据抗体胶体金与被检测物结合……   
[关键词]:鼠疫;斑点金;薄层色谱;胶体金;鼠疫菌
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国人民解放军军事医学科学院2006年