手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

抗人CD28单链抗体和嵌合抗体转移载体的构建及单链抗体基因在BmN细胞中的表达

朱艳

   CD28分子是表达于T淋巴细胞表面的跨膜糖蛋白,参与介导T细胞活化所需的协同刺激信号,属于免疫球蛋白超家族。已有的研究表明,CD28单克隆抗体对肿瘤、自身免疫性疾病及移植排异等均具有重要的治疗意义,但体内长期使用会降低治疗效果。为了降低人抗鼠免疫反应,必须在临床应用前对CD28单克隆抗体进行改造。本研究在对抗人CD28单克隆抗体进行改造的基础上,成功构建了杆状病毒转移载体,并在BmN细胞中进行表达。主要成果如下: 1、将抗人CD28鼠源性单抗的可变区基因和人IgG1的恒定区基因,采用一种不需要限制性核酸内切酶和连接酶的新方法——三引物PCR(TP-PCR)法拼接成嵌合抗体基因,分别插入杆状病毒转移载体pAcUW3的ph和p10启动子后,成功构建了抗人CD28的重组转移载体pAcUW3/CD28-vH-γ_1,vL-κ。 2、采用TP-PCR法,将抗人CD28单抗的重、轻链可变区基因和人工设计的昆虫杆状病毒多角体蛋白基因偏好的连接肽序列,拼接成抗人CD28单链抗体基因,并将其插入昆虫杆状病毒转移载体pBacPAK8的ph基因启动子后,构建成重组转移载体pBacPAK8/CD28-ScFv。基因拼接时,在抗体链段的C端增加了6×His tag序列,便于表达产物的纯化。 3、采用脂质体介导的方法将重组转移载体pBacPAK8/CD28-ScFv和线性化的Bm-BacPAK6共转染BmN细胞,利用空斑分析以及蓝白斑筛选相结合的方法,筛选出重组杆状病毒Bm-BacPAK6 CD28-ScFv,并用PCR方法对此重组病毒进行了鉴定。 4、将重组病毒Bm-BacPAK6 CD28-ScFv接种BmN细胞,定期收取感染细胞,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western Blotting分析。结果表明,在分子量约为28kD处有一清晰的亮带,说明抗人CD28单链抗体基因在BmN细胞中得到了特异性表达。表达始于24h,表达峰在72h。 抗人CD28单链抗体和嵌合抗体基因转移载体的成功构建及抗人CD28单链抗体基因在BmN细胞中的表达为抗人CD28基因工程抗体的研制奠定了基础。……   
[关键词]:CD28;单链抗体;嵌合抗体;转移载体;BmN细胞
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:苏州大学2006年