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重组人白细胞介素-15的原核表达和治疗肿瘤的研究

唐峰

  白细胞介素-15(IL-15)是Grabstein等人于1994年发现的一种具有免疫调节活性的细胞因子,它具有与白细胞介素-2(IL-2)相似的生物学功能,可促进T细胞、B细胞、自然杀伤细胞(NK)的增殖与分化,增强细胞毒T细胞(CTL)/NK细胞的细胞毒活性等,并能发挥优于IL-2的抗肿瘤作用。本论文是在我们的前期工作基础上,通过基因工程技术和蛋白质纯化技术获得了纯度在95%以上的重组人白细胞介素-15(rhIL-15),并用建立的小鼠肿瘤模型,研究了rhIL-15的抗肿瘤作用,为将rhIL-15开发成一类抗肿瘤新药奠定了基础。本论文工作主要研究内容包括三部分:(1)rhIL-15的原核表达、纯化和鉴定;(2)抗rhIL-15单克隆抗体的制备;(3)rhIL-15的急性毒性实验和抗肿瘤作用研究。(1)rhIL-15的原核表达、纯化和鉴定根据已知人白细胞介素-15(hIL-15)成熟蛋白的氨基酸序列,在不改变氨基酸序列的前提下,采用大肠杆菌偏爱密码子合成寡核苷酸片段,通过拼接PCR法成功合成hIL-15基因,分别插入原核表达载体pGEX-2T、pET_(30a)、pET_(42)、pETBlue-1或pBV_(220),在多种宿主菌中获得了表达,最后筛选到稳定高效表达rhIL-15的工程菌株,即BL_(21)Star~(TM)(DE3)plysS/pBV_(220)-IL-15。在工程菌BL_(21) Star~(TM)(DE3)plysS/pBV_(220)-IL-15中,rhIL-15以包涵体形式表达,最高表达量为菌体总蛋白的15.2%。经蛋白印迹法鉴定表明,此rhIL-15能与抗hIL-15的单克隆抗体特异结合。诱导表达后,分离出包涵体,经反复洗涤后,溶于6mol/L盐酸胍,获得rhIL-15粗品。再经反相层析分离后溶于8mol/L尿素,经透析或稀释复性获得有生物活性的rhIL-15,复性后的rhIL-15依次经DEAE弱阴离子交换层析和Sephadex G-25脱盐得到纯化的rhIL-15。纯化的rhIL-15行SDS-PAGE鉴定及光密度扫描分析,结果显示,纯度在95%以上。N端氨基酸序列分析结果表明,此rhIL-15 N端的前15个氨基酸序列与预期的一致;毛细管电泳分析表明,纯化rhIL-15的纯度接近100%,等电点为4.14,接近rhIL-15的等电点理论值4.42。纯化rhIL-15的体外促CTLL-2细胞增殖活性为6.7×10~6U/mg。因此,可以确定分离纯化的表达蛋白即是rhIL-15。……   
[关键词]:人重组白细胞介素-15(thIL-15);原核表达和纯化;小鼠肺腺癌LA795细胞;小鼠黑色素瘤B16细胞
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:中国协和医科大学2005年