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Foxp3转染的CD4~+CD25~- T细胞低反应的研究

肖亚

   器官移植是治疗终末期器官疾病的重要方法之一,但移植后的排斥反应仍是影响移植物存活的关键问题。虽然,临床上通过应用免疫抑制剂使器官移植后排斥反应有所减轻,但目前免疫抑制剂以牺牲受者免疫系统功能为代价,这严重影响了患者的生存质量。如何才能使受者对供者器官不发生排斥反应而又不损害受者免疫系统,即诱导受者产生针对供者器官的特异性免疫耐受,成为当前移植免疫学界研究的重点。 在器官移植排斥反应中,T细胞起关键作用。器官移植的最终目的是建立如天然自身耐受般的移植物耐受,而不需要持续的非特异性地免疫抑制。研究发现,CD4~+CD25~+ T淋巴细胞在天然自身免疫耐受中起重要作用,但其数量很少。而Foxp3基因转染可使CD4~+CD25- T淋巴细胞具有Treg细胞的功能。这样由异型抗原反应性T细胞准备的抗原特异性Foxp3转导的T细胞或过继的Treg细胞在细胞治疗中可以作为一种手段。这些体内外诱导针对移植器官的免疫耐受的方法原则上能够在自身免疫疾病中重建自身免疫耐受。 目的: 通过基因转染技术将Foxp3基因导入CD4~+CD25- T淋巴细胞,使之表达。然后输入自身免疫疾病模型体内重建自身免疫耐受,为临床控制抗原特异性免疫反应,体外定向操纵调节T细胞,诱导移植耐受以及治疗排斥反应奠定基础。 方法: 一、质粒pmFoxp3-IRES2-EGFP的构建 采用DNA重组技术,RT-PCR法从Balb/c小鼠的单核细胞悬液中获得Foxp3 cDNA,将Foxp3的PCR产物纯化后,直接与T载体pMD18-T进行连接反应并通过蓝白斑筛选出白色的阳性克隆。扩增阳性克隆,提取重组质粒。用限制性内切酶EcoRⅠ和Bgl II对重组质粒pMD18-T-Foxp3及pIRES2-EGFP质粒进行双酶切,回收目的片段进行连接。连接产物转化感受态DH5α后,扩增并提取重组质粒pmFoxp3-IRES2-EGFP。 二、免疫磁珠法分离T淋巴细胞 采用Regulatory T Cell Isolation Kit,阴性选择分离CD4~+CD25-T淋巴细胞,阳性选择分离CD4~+CD25~+T淋巴细胞。胎盼兰染色检测其活性,流式细胞仪检测细胞纯度。……   
[关键词]:移植;Foxp3;基因治疗;电穿孔;免疫抑制
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:第三军医大学2006年