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侵染大蒜的线状植物病毒的外壳蛋白基因原核表达、抗血清制备及检测应用

鲁宇文

  大蒜病毒病害是造成其产量损失和品质下降的重要原因,侵染大蒜的植物病毒主要包括马铃薯Y病毒属(Potyvirus)的洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus,OYDV)、韭葱黄条病毒(Leek yellow stripe virus,LYSV),麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)的葱潜隐病毒(Shallot latent virus,SLV),大蒜普通潜隐病毒(Garlic common latent virus,GarCLV),马铃薯X病毒属(Potxvirus)的薤X病毒(Scallion virus X,ScaVX)以及葱属X病毒属(Allexivirus)的大蒜A病毒(Garlic virus A,GarV-A)、大蒜B病毒(Garlic virus B,GarV-B)、大蒜C病毒(Garlic virus C,GarV-C)、大蒜D病毒(Garlic virus D,GarV-D)、大蒜E病毒(Garlic virus E,GarV-E)和大蒜X病毒(Garlic virus X,GarV-X)等。 根据已报道的序列,设计病毒特异性表达引物,应用PCR扩增GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X、OYDV、LYSV的CP基因,克隆至载体pGEM-T,并测序鉴定。随后构建各病毒的原核表达质粒,载体为pSBET。SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导的8个原核表达质粒分别转化的大肠杆菌BL21(DE3)pLysS高效表达相应的预期大小的CP。通过12%SDS-PAGE和5%-20%梯度SDS-PAGE二次制备电泳纯化目的蛋白并免疫小鼠(ICR),制备相应的CP抗血清。Western blot分析表明抗血清与所对应的CP反应较强,特异性较好。 先用制备好的GarV-A的CP的抗血清,分别与原核表达好的GarV-A、GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X的CP作Western-blot分析,来研究GarV-A的CP与该属其他成员CP的血清血关系。以此类推,通过Western-blot的方法来确定GarV-B、GarV-C、GarV-D、GarV-E、GarV-X的CP与该属其他成员CP的血清血关系。通过实验发现,GarV-D和GarV-E的CP在血清学上关系密切,具有强烈的交叉反应,而与相其他病毒的CP只有较弱的反应带。同时还发现GarV-E和GarV-A的CP、GarV-X和GarV-A的CP、GarV-X和GarV-B的CP、GarV-X和GarV-C的CP也存在类似的关系。 Western blot分析表明,OYDV与LYSV血清学远缘相关。对大蒜田间样品的间接ELISA检测表明,OYDV和LYSV在田间普遍发生,且通常为复合侵染。两者间微弱的血清学交叉反应对ELISA检测结果影响极小,可用于样品检测。 在测定GarV-X基因组全序列的基础上,将全序列分为4个片段,设计特异……