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伊维菌素的抗体制备及ELISA法残留分析

张梅

  伊维菌素(Ivermectin,ⅣM)属于大环内酯类抗生素,由于其优良的驱虫活性而广泛应用于畜牧业。然而作为高毒性化合物和在动物体内的长效特性,ⅣM在动物组织中的残留不容忽视。本研究旨在制备和筛选针对ⅣM的多克窿抗体,并以此抗体为核心试剂建立检测动物组织中ⅣM残留的ELISA快速检测方法。 本研究将伊维菌素(Ivermectin,ⅣM)制备成半抗原4″-O-(单)-琥珀酰ⅣM和5-O-(单)琥珀酰ⅣM,质谱鉴定其分子量为976和976.3,与目标产物分子量一致。将半抗原4″-O-(单)-琥珀酰ⅣM与载体蛋白BSA和PLL偶联,制备了免疫抗原4″-O-(单)-琥珀酰ⅣM-BSA和4″-O-(单)-琥珀酰ⅣM-PLL;将半抗原5-O-(单)琥珀酰ⅣM和PLL偶联,制备了又一免疫抗原5-O-(单)琥珀酰ⅣM-PLL。半抗原5-O-(单)琥珀酰ⅣM与载体蛋白OVA偶联,制备了包被抗原5-O-(单)琥珀酰ⅣM-OVA。在免疫抗原5-O-(单)琥珀酰ⅣM-PLL的制备中,采用正交试验设计对该合成的反应条件进行选择,结果为在Ph8.5,PLL35mg,4℃,8小时时收率52.6%和偶联比为30.2,为最佳结果。免疫抗原与包被抗原经SDS-PAGE电泳鉴定,载体蛋白与半抗原的结合比1:14.5~1:30.2。 以4″-O-(单)-琥珀酰ⅣM-BSA、4″-O-(单)-琥珀酰ⅣM-PLL和5-O-(单)琥珀酰ⅣM-PLL作为免疫抗原免疫新西兰白兔,经过5次免疫后,三抗血清的效价可达1:10~5。通过非竞争抑制试验对血清效价测定结果及抗体纯化后的Western blot结果,可以看出以4″-O-(单)-琥珀酰ⅣM-PLL和5-O-(单)琥珀酰ⅣM-PLL作为免疫抗原制备得到的抗体,在免疫原性和对ⅣM的特异性上,无明显差异。因5-O-(单)琥珀酰ⅣM-PLL较4″-O-(单)-琥珀酰ⅣM-PLL的合成过程大大简化,在以后建立的ELISA检测方法中,以抗4″-O-(单)-琥珀酰ⅣM-BSA抗体和抗5-O-(单)琥珀酰ⅣM-PLL抗体为基础建立ELISA竞争性抑制试验。通过方阵法确定包被抗原、抗体的最适工作浓度,结果表明包被抗原的包被浓度为30μg/ml,两抗体的稀释倍数均为1;10~5,酶标二抗的工作浓度为1:1000。通过正交试验优化选择ELISA检测ⅣM残留的竞争反应条件,结果表明pH值(6.4~8.4)、离子强度(0.05~1.5M NaCL)和甲醇浓度(5~15%(v/v))对两种抗体的ELISA竞争反应均无明显影响,两种抗体建立的ELISA竞争反应中均以pH值7.4、离子强度0.50M(NaCL)和10%甲醇为基础反应条件。 研究中同时建立的三种抗体在选择同一个包被原和不同包被原时,共四个试验组合,来进行ⅣM的ELISA残留分析时的标准曲线,并比较了四组合在残留检测最低限和灵敏性的不同。对四个曲线分析结果为所设计的四个试验在用于ⅣM的残留检测时,均能满足ⅣM残留检测要求,其中检测限最低的为0.83ng/g,IC_(50)最高的为7.01ng/g。对曲线的分析结果看出,以PLL做ⅣM的免疫增强载体时优于BSA。 研究中采用的ELISA方法检测动物四种组织(肌肉、肝脏、血浆和牛奶)中的ⅣM,设计两个不同抗体和包被原组合方案,进行了同收率的确定。两个试验中(第四章试验5)对动物组织中添加ⅣM检测回收率在93.9%~101.2之间,变异系数不超过5.1%,(第四章试验6)对动物组织中添加ⅣM检测回收率在92.6%~101.7%之间,变异系数不超过6.3%,均为比较理想的结果。 研究结果表明,以抗4″-O-(单)-琥珀酰ⅣM-BSA抗体和抗5-O-(单)琥珀酰ⅣM-PLL抗体为……   
[关键词]:伊维菌素(IVM);阿维菌素类(AVMs);聚-L-赖氨酸(PLL);残留分析;酶联免疫(ELISA)
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国农业科学院2006年