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大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位的克隆、表达、初步纯化及免疫活性的研究

黄思扬

  目前所知道的最强的粘膜免疫抗原当属霍乱毒素(cholera toxin CT)与大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin,LT),但是两者分别能引起典型的霍乱样腹泻,及旅行者腹泻。同时它具有很强的潜在的免疫原性及粘膜免疫佐剂效应,以他们作为佐剂能够显著刺激增强机体对抗原的免疫反应,但是其毒性限制了其的应用,随着LT的三维结构的获悉,推动了人们对其B亚单位及其减毒突变体的研究,期望得到具有很强的粘膜佐剂活性,同时其毒性具有相对较低甚至没有毒性的突变体。本实验的目的是为了研究大肠杆菌不耐热肠毒素(Escherichia coli heat-labile enterotoxin(LT))B亚单位(LTB)的免疫佐剂活性。从产肠毒素大肠杆菌44815#菌株中提取其大质粒DNA,根据GENE BANK的序列设计引物调出LTB的原始基因,并将该基因通过PCR的手段进行扩增。进而将该基因克隆入pMD 18-T vector,通过PCR及双酶切进行筛选鉴定,阳性克隆测序。将正确的基因克隆到原核表达载体pET-21b(+)中,得到重组原核表达株(pET21b-LTB),经氯化钙法转化大肠杆菌BL21(DE3),通过PCR及IPTG诱导表达经过SDS-PAGE筛选阳性克隆,命名为pET21b-LTB。表达产物经SDS-PAGE分析,分子量为14KD,与理论值相符。凝胶灰度扫描显示pET21b-LTB表达量约占菌体总蛋白的16%。将构建好的重组菌株进行扩大培养,离心收集细胞,经超声破碎后离心收集破碎上清、通过阳离子交换柱(CM-FF)对目的蛋白进行初步纯化。以该纯化蛋白为佐剂,将其分别与流感三价疫苗,Ⅱ型疱疹病毒(HSV-Ⅱ)gD糖蛋白混合后通过腹腔注射及鼻饲法免疫BALB/c小鼠,设单纯铝佐剂免疫为对照。免疫2,4,6周后尾静脉采血,ELISA法检测其抗体水平,检测抗体水平升高后。将小鼠摘除眼球采血,全部处死后取其鼻、肺、肠及阴道洗液检测sIgA抗体水平,取其血清检测IgA、IgM、IgG抗体水平。通过与氢氧化铝佐剂对比表明其滴度显著高于氢氧化铝佐剂对照组。结果表明:重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位具有粘膜免疫佐剂功效,该研究结果为今后LTB的研究及应用奠定了基础。……   
[关键词]:大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位;表达;纯化;粘膜佐剂
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:兰州大学2006年