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猪细胞因子cDNA文库的构建及其重要功能基因的筛选和克隆

夏小慧

  构建cDNA文库并从中筛选克隆基因是获得基因的一种可靠方法。目前尚未见猪细胞因子cDNA文库构建的报道,因此本实验开展了猪细胞因子cDNA文库的构建及重要细胞因子基因筛选克隆研究工作。1、采健康猪外周血及淋巴结,分离单个核细胞,经LPS+PHA不同剂量联合刺激不同时间,使单个核细胞活化,大量转录、表达和分泌细胞因子。提取活化细胞总RNA,将各组样品混合,分离纯化mRNA。按cDNA文库构建试剂盒说明构建cDNA文库。测定原始库容量,重组率及插入片段的大小。结果表明:成功构建了猪细胞因子cDNA文库,文库原始库容量为8×10~5,插入片段大约在300bp~2000bp之间,重组率为93.3%。2、为进一步从文库中筛选新基因,建立膜原位杂交技术平台,选用了一随机基因进行DIG标记,与其自身的噬斑进行杂交反应,同时设立对照,来确定该杂交体系的可靠性。结果显示,该杂交反应检测灵敏度高,可检出0.4pg/μL的目的克隆,与对照相比,其假阳性率低,能够作为一种有效的核酸杂交方法用以筛选新基因。3、用特异性引物在文库中扩增到猪IL-2和IL-4基因,并成功插入到pMD18-T载体。DNA测序及DNAstar软件分析,IL-2基因的开放阅读框为465bp,编码154氨基酸残基的前体蛋白,分子量约为17.4ku,与GenBank上登录的IL-2基因cDNA序列同源性为99.1%;IL-4基因的开放阅读框为402bp,编码133个氨基酸残基的前体蛋白,分子量约为15ku,与GenBank上登录的IL-4基因cDNA序列同源性为99.3%。证明所克隆基因为全长的IL-2和IL-4基因。……   
[关键词]:细胞因子;cDNA文库;基因克隆;基因筛选;膜原位杂交;IL-2;IL-4
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:兰州大学2006年