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植物SAMDC基因分子进化分析以及ySAMDC基因转化番茄研究

丁淑丽

  多胺广泛存在于所有生物中,并且在植物的生长发育过程中起重要的作用。S-腺苷甲硫胺酸脱羧酶(SAMDC)是多胺合成途径中的一个关键调节酶基因。SAMDC催化腺苷甲硫氨酸(SAM、AdoMet)形成脱羧的SAM,它为多胺生物合成提供氨丙基供体。多胺与乙烯具有共同的合成前体物质SAM。乙烯和多胺是具有重要生理作用的两类生长调节物质,并和成熟衰老过程相关。因此研究SAMDC的分子特征及调节作用有很大的现实意义。本研究选用模式植物番茄作为遗传转化受体,引入多胺生物合成途径中的关键调节基因ySAMDC基因,以期为进一步分析SAMDC基因在调节多胺的合成中的作用、多胺水平和多胺在诱导基因的表达中的功能以及探讨能否通过对SAMDC的调控进行作物改良奠定基础。同时利用同源基因克隆方法分离了十字花科SAMDC基因,试图从分子水平阐明植物SAMDC基因进化关系,为进一步探索SAMDC的生物学功能提供研究基础。因此,我们建立了番茄离体培养植株再生体系,构建了ySAMDC基因植物表达载体,并将目的基因导入根癌农杆菌LBA4404菌株中,进行了番茄的遗传转化研究,获得了80株番茄Hyg~R植株。主要研究结果如下:(1)通过不同的激素配比的筛选,提出了一个番茄离体培养再生频率较高的培养基配方(MS培养基+3%蔗糖+0.8%琼脂+1mg/L BAP+0.15 mg/L IAA),子叶和下胚轴外植体的再生频率分别达90.7%和94.2%。(2)经过对番茄外植体Hyg筛选浓度的确定、抑菌剂Cef的敏感性试验、Hyg对生根的影响,建立了一个番茄遗传转化体系。具体操作为:将番茄子叶外植体在预培养基上培养2d后,用含目的基因的pBI35S-SAM和pBIE8-SAM农杆菌LBA4404菌液侵染5~10min,在灭菌滤纸上吸干菌液,置于共培养基上培养2d,随后将外植体转入含Hyg7mg/L的选择分化培养基上诱导不定芽,2-3周转瓶一次,当抗性不定芽长至2-3cm时,在愈伤组织处切下幼苗,置于生根培养基上诱导不定根,15d左右后不定根长成,开瓶炼苗,然后移栽至营养土中,正常管理。(3)按已建立的番茄遗传转化体系,获得了80余株潮霉素抗性苗,对40株Hyg~R转基因番茄植株进行了PCR检测、RT-PCR检测、和GUS组织化学染色。结果有32株含1100bp ySAMDC基因扩增产物。(4)根据GenBank中已报道的SAMDC基因编码的氨基酸保守区域设计特异引物,运用PCR技术分别从十字花科6属14个物种中新克隆分离了SAMDC基因的同源序列。根据核苷酸序列构建了NJ与ME分子系统树。进化树直观地表明在亲缘进化关系上芸薹属与萝卜属较近,其他依次为山芥属、蔊菜属、拟南芥属,与荠菜属最远。本研究结果有助于从分子水平阐明十字花科植物间的亲缘进化关系,可为植物种质资源利用提供理论依据。……   
[关键词]:番茄;ySAMDC;番茄红素;遗传转化;十字花科植物;进化分析
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:浙江大学2006年