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Pima90-53细菌人工染色体(BAC)文库构建及抗黄萎病相关基因筛选

王文生

  棉花是当今人类栽培的主要作物之一和天然纤维的首要来源。目前,四倍体的陆地棉(Gossypium hirsutum L.)和海岛棉(Gossypium barbadense L.)是世界各国的主要栽培种,它们分别占世界棉花总产量的90%和8%。海岛棉纤维细长、强力高、抗病性较强,是品质最优的栽培种。因此构建海岛棉品种的BAC文库,利用国内外已有分子标记探针钓取和分析含有重要性状的BAC克隆,是发掘分子标记、克隆纤维发育相关基因和抗病基因、深入开展棉花功能和比较基因组学研究的基础和关键。对于显著提高我国棉花遗传育种研究水平具有重要意义和应用前景。本研究以优质抗病海岛棉品种Pima90-53为材料,在本课题组BAC文库构建方法的基础上,进行了一些改进,补充构建了该品种的BAC文库,获得了77,568个克隆,使得该文库的克隆总数达到167,424个。随机挑取224个克隆进行插入片段大小检测,其平均片段大小介于50kb~260kb之间,平均插入片段为130kb,94%的插入片段在100kb以上,空载率小于4%;该基因组文库中叶绿体基因的污染率低于0.2%;该文库覆盖海岛棉基因组的7.2倍:Southern杂交结果表明所构建的Pima90-53 BAC文库具有较高的忠实度:随机挑取7个克隆进行继代培养100代,提取质粒酶切检测表明不存在片段丢失现象,表明该文库的克隆在大肠杆菌中能够稳定保存;用单拷贝的分子标记Fb38和多拷贝的分子标记MYB作为探针对该文库进行了部分筛选,分别得到2个和40个阳性克隆。这些结果表明该文库具有较高的质量,为开展棉花重要性状基因的图位克隆、棉花物理作图、基因组测序和SSR引物开发等应用提供了重要基因组资源。以黄萎病菌诱导下差异表达的棉花抗病相关基因片段PR8为探针,利用杂交方法,对所构建的优质、抗病海岛棉品种Pima90-53 BAC文库进行了筛选。从30,336个BAC克隆中筛选到含有PR8基因片段的4个阳性克隆,分别为127K13、128D14、169J3和178C5。用Sau3A Ⅰ对其中的169J3克隆进行酶切,回收2kb~4kb的DNA片段并连接到载体pUC118BamHⅠ-BAP上,构建了含有该基因片段的亚克隆文库,该文库共含有4,224个克隆,平均插入片段为2kb。通过对亚克隆的测序分析初步得到了一条与转运蛋白相关的基因片段,该片段长2.3kb,含有五个开放阅读框。通过比对分析发现该基因片段与水、冷害、茎点霉属胁迫下表达的基因有较高的同源性,该片段可能在棉花抗病反应的信号传导中起作用。该基因片段的获得为得到抗黄萎病相关基因片段PR8的完整序列、开发与抗黄萎病相关的SSR标记提供了重要的基础。……   
[关键词]:棉花;Pima90-53;BAC文库;纤维品质;黄萎病
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北农业大学2006年