手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

苏云金芽孢杆菌杀虫基因的克隆和杀虫假单胞工程菌的构建

毛文杰

  由于苏云金杆菌在使用过程中存在的一些不足及害虫对其抗药性的产生,人们逐渐转向利用生物技术将Bt的杀虫基因转入其它更有优势的微生物中。本研究从本实验室分离的野生型苏云金芽孢杆菌中克隆有特异杀虫活性的vip3A基因和cry1Ba基因,并将其转入到植物根际有益微生物中,构建杀虫防病的工程菌。利用PCR-RFLP方法对本实验室分离的苏云金芽孢杆菌WZ-7和sfw12菌株进行了基因型鉴定。鉴定结果表明,WZ-7中含有cry1Ab和vip3A,sfw12中含有cry1Ba基因。根据vip3A和cry1Ba的基因序列分别设计引物,利用PCR方法从本实验室分离的苏云金芽孢杆菌WZ-7和sfw12菌株中扩增得到vip3A-WZ7全长序列及cry1Ba-sfw12片段。将PCR产物连入T-载体并测序,得到的vip3A-WZ7基因序列翻译为Vip3A-WBS蛋白一级序列,利用NCBI在线的Blast软件进行同源性分析。结果表明,该蛋白与已报道的10余个Vip3A蛋白同源性达99%以上,与其它蛋白无同源性。同样方法证实Cry1Ba-sfw12与Cry1Ba蛋白的同源性达99%。将克隆的vip3A-WZ7基因插入携带Tn5转座子的pAG408自杀性质粒,并将其转化到大肠杆菌S17-1(λ_p),通过接合转移,将vip3A基因整合到假单胞菌染色体上,根据发光强度,并结合生物测定,挑选出杀虫活性高的Pshvip9接合子,PCR鉴定表明vip3A基因已经插入假单胞菌染色体。生物测定结果表明,工程菌Pshvip9对棉铃虫及甜菜夜蛾有较好的胃毒活性,LC_(50)分别为1.02x10~8 cells/mL和6.95x10~7 cells/mL。室内平板抑菌实验表明,其对黄瓜枯萎病菌和小麦根腐病菌及大肠杆菌和Bt等有较强的抑菌作用,与出发菌株差别不大。对工程菌生长曲线的测定表明18h左右就可达到稳定期。对该工程菌同时在灭菌土和自然土中进行了小麦根部定殖试验,结果表明,在20天左右时能达到3~4x10~6CFU/g土壤。以上结果表明,将vip3A基因导入野生型假单胞菌PHB158中,并未使其抑菌、定殖等功能发生改变。将该工程菌不同培养基条件下培养,结果表明其在BPY培养基中生长最好。……   
[关键词]:营养期杀虫蛋白;杀虫晶体蛋白;工程菌;定殖;抑菌活性
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北农业大学2006年