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α-乙酰乳酸脱羧酶产生菌的遗传标记及融合育种

郑应福

   α-乙酰乳酸脱羧酶可以去除啤酒中的双乙酰,在啤酒工业中有着广泛的应用前景。原生质体融合技术在育种中有着独特的优势。利用抗生素标记筛选融合子方法简便并且对酶活的影响较小。因此,对本实验室保存的两株产α-乙酰乳酸脱羧酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)进行原生质体融合,筛选高酶活菌株。 实验首先对3226-5进行了青霉素抗性标记获得抗性突变株P-67;V-20进行了链霉素抗性标记获得抗性突变株S-17。P-67和S-17作为原生质体融合的亲本。然后,根据双亲菌株的生长曲线确定了其培养时间。将菌株由斜面接种到完全固体培养基上,活化培养24h,再将其接种到液体完全培养基,37℃,200rpm,摇床培养14h,最后按5%的接种量接种到20mL的液体完全培养基,继续培养3.5-4h。 将培养好的菌体收集起来,进行溶菌酶处理,制备原生质体。本实验选择了多个溶菌酶浓度,酶解时间,酶解温度处理双亲菌株进行原生质体的形成和再生实验,通过绘制形成率和再生率曲线确定P-67的酶解条件是20μg/mL的溶菌酶在32℃酶解20min原生质体的形成率和再生率较高;S-17的酶解条件是15μg/mL的溶菌酶在32℃酶解20min原生质体的形成率和再生率较高。确定最佳融合条件为35%PEG6000,38℃处理15min,Ca~(2+)的浓度为50mmol/L,以及融合体系pH为9.0,在此条件下原生质体的融合率为1.8×10~(-5)。本实验共得到了287株融合子,将这些融合子测定酶活。最后筛得F-589菌株,其酶解后的上清液酶活达到157.59μ/g高于亲株37.2%。 对F-589进行了利福平的抗性标记,最后,获得一株高酶活的菌株R-4-250,酶活达到194.78μ/g比F-589的酶活高23.60%,高于亲株69.58%。……   
[关键词]:枯草芽孢杆菌;α-乙酰乳酸脱羧酶;抗性标记;原生质体;融合
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北大学2006年