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2-萘酸加单氧酶基因及NADH:黄素还原酶基因的克隆与分析

李小波

  偶氮芳香族化合物在自然界广泛存在,而且每年以数百万吨的数量被制造出来。许多偶氮芳香族化合物在化工工业上有重要用途,但该类化合物在使用过程中往往会造成严重的环境污染。2-萘酸是一种在化学结构上类似偶氮芳香族物质基本结构萘磺酸的化合物,研究2-萘酸的微生物代谢途径,确定其代谢过程中的酶系统以及对应的代谢基因,可以为偶氮类化合物的微生物降解提供理论依据,为通过基因工程技术构建多功能高效的环境污染物降解菌创造条件。伯克霍尔德氏菌(Burkholderia sp.)JT1500 是一株2-萘酸(2-naphthoate)降解菌,通过该菌株的转化作用,1mol 的2-萘酸可被转化为1mol 的丙酮酸,1mol 的琥珀酸,1mol 的乙酰CoA 和2mol 的CO_2, 在该过程中2-萘酸生物降解的关键步骤之一是通过2-萘酸加单氧酶羟化2-萘酸生成1-羟基-2-萘酸(1-hydroxy-2-naphthoate)。本研究对含有该2-萘酸加单氧酶基因的一个4.8kb 长度的基因簇进行了克隆测序,该序列上可合理地读出4 个阅读框orfB、orfC、orfD、orfA。序列比对发现,orfA 序列与Japonicum USDA 110 和Rastonia eutropha HF 39 中的加单氧酶基因同源性较高,orfB 序列与Bordetlla pertussis Tohama I 、Rastonia solanacearum GMI1000 和Bordetella bronchiseptica RB50 等菌中的黄素还原酶基因有一定的同源性。采用根据DNA 序列信息设计相应引物,分别构建含有不同阅读框的重组子,对不同阅读框编码的基因功能进行了确定。酶活分析发现只含基因orfA 的重组大肠杆菌SA的细胞提取液有很低的加氧活性,含基因orfB 的重组子SB的细胞提取液没有加氧活性,但在反应体系中同时加入S_A和S_B的细胞提取液后,其加氧活性显著增强,包含orfB+orfA 的重组子SB+A 在黄素(FMN、FAD)存在的条件下也表现出很强的加氧活性;在厌氧条件下,能检测出SB细胞提取液的黄素还原活性。基于以上信息,可以认定2-萘酸加单氧酶基因nmo 是由黄素还原酶基因(nmoB)和加单氧酶基因(nmoA)组成,由2-萘酸加单氧酶Nmo 羟化2-萘酸的关键一步应为:先由黄素还原酶(NmoB)在NADH 存在的条件下将黄素(FMN、FAD)还原为还原型黄素(FMNH2、FADH2),然后2-萘酸加单氧酶(NmoA)利用还原型黄素和分子O2羟化底物2-萘酸,生成1-羟基-2-萘酸。NmoB 是NmoA 的偶联蛋白。该2-萘酸加单氧酶的发现为双组分非亚铁血红素型黄素扩散加单氧酶(TC-FDM, two-component nonheme flavin-diffusible monooxygenase)家族增添了新成……   
[关键词]:2-萘酸;加单氧酶;黄素还原酶;基因克隆
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:中国科学院研究生院(武汉病毒研究所)2005年