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梯度糖溶液及强骨宝方不同添加法对体外培养成骨细胞影响的实验研究

陈智能

  目的:探讨梯度高糖及强骨宝方不同添加法对体外培养OB的影响。方法:采用胰蛋白酶-Ⅱ型胶原酶消化法从1-2日龄SD大鼠颅盖骨中分离出OB,倒置显微镜下观察其形态、改良Gomori氏钙钴碱性磷酸酶染色法(Alkaline phosphatase,ALP)、茜素红(ARS法)钙化结节染色法、Van-Gieson Ⅰ型胶原染色法鉴定细胞后,取第2—5代生长旺盛的OB进行实验。第一步,用MTT法检测OB增殖能力:①用不含与含不同浓度糖溶液的α-MEM培养液进行培养对照;②用不含与含不同浓度强骨宝方提取液的α-MEM培养液分别加入到正常及高糖(糖终浓度为300mg/dl)OB培养体系进行培养对照;③用不含及含不同时效(灌胃3d、5d,末次灌胃1h、3h)、不同浓度(5%、10%、20%)强骨宝方的DM模型鼠血清(载药血清)的α-MEM培养液加入OB培养体系,进行不同培养时段对比观察。第二部,在第一步的基础上,应用氨基安替比林测酚法(金氏法)进行ALP含量测定、茜素红染色方法(ARS法)进行矿化结节计数等检测各组(除外强骨宝方提取液高糖培养体系组)对OB分化和成骨能力的影响。第三部,用放射免疫法及荧光分光法检测含与不含载药血清培养体系48h、72h培养上清液细胞因子(IL-6、TNF-α)的含量,7d、10d培养上清液AGEs的含量,观察强骨宝方对AGEs的形成及OB分泌细胞因子的影响。结果:(1)采用胰酶-胶原酶消化法,进行体外OB分离培养,可以获得比较纯化的OB。(2)不同浓度的糖溶液在OB培养48h时具有明显的促进增殖作用,但≥15mmol/L的溶液在72h时则呈抑制效应,其中以<15mmol/L的糖溶液在培养早期有显著促进作用(P<0.05或<0.01)而在培养较长时也无明显抑制效应;≥30mmol/L的糖溶液培养7d时显著抑制OB分化(P<0.05);≥10mmol/L的糖溶液在培养18d时对矿化结节的形成也具有明显的延迟效应;<10mmol/L的糖溶液对OB分泌ALP及矿化结节形成无抑制作用。(3)100μg/ml、……   
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