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重组D-氨基酸氧化酶的表达、纯化与固定化

林欣

  三角酵母D-氨基酸氧化酶(Trigonopsis variabilis D-Amino Acid Oxidase,TvDAAO)是生产制药中间体7-氨基头孢烷酸(7-ACA)的一种具有重要工业价值的一种酶,用已经构建好Tv DAAO的表达载体pLHB-3在大肠杆菌中经乳糖导发酵表达,获得的菌体提取粗酶液,经以琼脂为基质的树脂FP-IDA-Co一步纯化后,于25℃,5%CPC条件下检测,每升发酵液的酶活为2900U,纯酶比活为16U/mg,纯化了16倍,纯酶的收率为70%。将DAAO纯酶液固定到环氧树脂Amberzyme~(TM)上,固定化酶的酶活达到142U/g,能够连续10批转化底物而酶活没有明显损失,对底物的转化率达到98%以上。本文实验数据表明,DAAO经亲和层析后固定到环氧载体上可为其应用于工业当中提供很好的方法途经。我们构建了透明颤菌血红蛋白(Vitreioscilla Hemoglobin,VHb)基因与TvDAAO基因的融合基因,来确认细菌血红蛋白能否作为固定化DAAO酶的氧供体从而提高DAAO酶活性。我们设计VHb的引物,并引入NcoI位点,用PCR方法扩增出VHb基因,将其克隆到pLHB-3中DAAO基因的前端获得表达载体pLX01,通过测序,序列正确,将pLX01与未融合VHb基因的pLHB-3质粒同时做诱导表达作对照,表达活性并没有明显提高。为获得新的DAAO基因,用RT-PCR方法去从粘红酵母(Rhodotorula gracilis)中获得DAAO的cDNA并将其克隆到pRSET(A)载体上,将重组质粒转化到大肠杆菌DH5a中,筛选到重组质粒pRSET-DAAO,抽取质粒转化pLysS/BL21(DE3)感受态细胞,得到重组大肠杆菌菌株LX02。在诱导温度为30℃,诱导菌株初始浓度为OD_(600)=0.8,诱导剂IPTG浓度为1mM时,能够检测到DAAO活力。……   
[关键词]:D-氨基酸氧化酶;发酵;纯化;固定化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:辽宁师范大学2005年