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昆白小鼠胚胎干细胞分离克隆及向心肌细胞定向诱导分化的研究

刘雨潇

  本研究从昆白小鼠胚胎中分离克隆出小鼠ES 细胞,并对其进行了传代培养和鉴定;并以ES-D3 为材料,采用不同的诱导物将小鼠胚胎干细胞向心肌细胞定向诱导分化。对影响小鼠ES 细胞分离与克隆及向心肌细胞定向诱导分化的的影响因素进行了探讨,为进一步建立昆白小鼠ES 细胞系及建立稳定的心肌细胞诱导体系奠定了基础。实验主要结果如下: 1. 从1678 枚昆白小鼠胚胎中分离培养ES 细胞,ICM 形成率为70%(1167/1678),有3 株传至第8 代。 2. 分别比较了桑椹胚,早期囊胚,扩张囊胚,孵化囊胚的贴壁率,生长行为和原代集落出现个数。结果表明孵化囊胚是最理想的ICM 分离材料。 3. 分别比较了全胚法,免疫外科法,酸处理法,酶消化对ES 细胞分离克隆的影响。发现利用全胚法培养孵化囊胚,是一种可行的ICM 分离方法,该方法操作简单,且能很好的保持ICM 的活力,利于传代。 4. MEF、STO、 HEF 及Sertoli 在小鼠胚胎贴壁率无显著差异(P>0.05);但在原代集落出现率及传代率上4 者有明显差异。MEF 最好,Sertoli 和STO 次之,HEF 效果最差。 5. 不同培养液对小鼠胚胎贴壁率及ICM 集落形成率无明显影响, ES 细胞培养液在ES 细胞分离传代上明显好于大鼠心肌细胞及肝脏细胞条件培养基(P<0.05);大鼠心肌及肝脏条件培养基可用于小鼠ES 细胞分离培养; LIF 对昆白小鼠ES 细胞的分离与克隆具有至关重要的作用。 6. 0.1% 胶原酶是较好的ES 细胞消化液,对细胞损伤力小,且传代后ES 细胞集落形成能力也较高(P<0.05)。0.25%胰酶+1%鸡血清与0.05%胰酶+0.008% EDTA 也可用于ES细胞传代; 0.25%胰酶+0.04% EDTA 对ES 细胞的损伤较大,不适于小鼠ES 细胞的分离与克隆。 7.分离得到的小鼠ES 细胞, AKP 染色阳性。Oct-4,SSEA-1 染色阳性。体外可自发分化为上皮样、神经样、成纤维样、表明提外培养的ES 细胞具有多能性。8.比较了小鼠ES 细胞在不同条件下分化为心肌的效率。结果表明单独使用5-氮胞苷或联合使用二甲基亚砜(DMSO)与维甲酸(RA)诱导均可促进ES 细胞分化为心肌细胞。其中5-氮胞苷的最佳浓度为15μmol/L,RA 的浓度为10-8~10-9mol/L。……   
[关键词]:昆白小鼠;胚胎干细胞;心肌细胞;分化
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:西北农林科技大学2005年