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谷氨酸棒杆菌发酵生产L-缬氨酸的研究

杨毅

  本文应用发酵原理及代谢工程的思想从代谢网络的角度出发采用增加目的产物的前体物质的育种策略,对实验室保藏菌株谷氨酸棒杆菌AATV341进行诱变选育以期达到高产L-缬氨酸的目的,并根据育种的具体情况采用乙酸盐-葡萄糖混合碳源培养和变温控制的策略,将细胞生长和产酸做为菌体发酵的两个不同阶段分开来考虑、研究,取得了很好的效果。实验对快速测定发酵液中L-缬氨酸的方法:纸层析-分光光度法进行了研究,确定了此方法适宜的测定条件,此方法的平均回收率为100.7%,适合发酵液中L-缬氨酸的准确测定。为研究设计育种过程叠加遗传标记给菌株带来的代谢变化,本文进行了L-缬氨酸的菌种选育的研究。本研究所选用的出发菌株谷氨酸棒杆菌AATV341是实验室保藏菌种。首先通过对原有的菌株进行营养因子的添加量的考察,了解了菌株的产酸情况,随后制定增加缬氨酸前体物质—丙酮酸为目的的诱变筛选策略。确定了生物素和VB_1在发酵生产缬氨酸时的最佳添加量分别为40μg/L和400μg/L。NTG的最佳诱变剂量是1 g/L,实验表明AATV341接入种子瓶培养15个小时后进行诱变,并再诱变进行30 min后终止反应效果最佳。通过多次亚硝基胍诱变,逐级叠加噻唑丙氨酸抗性(2-TA~r),氟代丙酮酸超敏(3-FPYR~(SS))和以琥珀酸为唯一碳源快速生长(Suc~g)的遗传标记,分别得到了三个突变株AT22(2-TA~r),AFT31(2-TA~r,3-FPYR~(SS)),AFTS134(2-TA~r,3-FPYR~(SS),Suc~g)。最终得到的菌株AFTS134缬氨酸产量为22.4g/L,比出发菌株AATV341的10.5 g/L的缬氨酸产量提高了118%,转接六次性状稳定。结合对谷氨酸棒杆菌的最新研究,研究了乙酸盐-葡萄糖混合碳源培养和变温控制工艺条件对谷氨酸棒杆菌AFTS134发酵生产缬氨酸的影响。得到如下的结论。出发菌株AFTS134在30℃,160 r/min,中发酵至24 h后向250 mL装液量为20 mL的摇瓶中添加0.02 g乙酸铵,使葡萄糖和乙酸铵的质量比达到9:1继续发酵至64 h可使缬氨酸的产量达到28.40 g/L,比不添加乙酸盐发酵液中缬氨酸浓度20.27 g/L提高了40%。出发菌株AFTS134在30℃,160 r/min发酵至32 h,将温度迅速提升到37℃,继续发酵至64 h,这段时期菌体生长停滞,糖耗速度加快,缬氨酸的合成速率也显著提高,最终产量为23.5 g/L比恒温下发酵产生的20.8 g/L的产量提高了11%。AFTS134在30℃,160 r/min下进行发酵,进行至32 h时,向250 mL装液量为20 mL的摇瓶中的发酵液添加0.02 g乙酸铵同时将发酵温度升至37℃。发酵至64 h结束。胞外缬氨酸的产量基本没有什么变化维持在20.8 g/L而谷氨酸的产量显著增加,提高了5倍。……   
[关键词]:谷氨酸棒杆菌;缬氨酸;育种;混合碳源培养;变温策略
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:江南大学2005年