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β-甘露聚糖酶和内切β-1,3-葡聚糖酶的基因克隆与表达

马骏双

  从20世纪50年代开始,酶制剂用作饲料添加剂,发展到今天已成为一类公认的高效、无毒、无副作用和环保型的“绿色”饲料添加剂。饲料用β-甘露聚糖酶的早期研究主要是传统的菌种筛选、诱变、诱导产酶和培养工艺等方面,近年来随着基因工程的发展越来越多地工作集中在酶的基因克隆和表达方面。内切β-1,3-葡聚糖酶用作饲料添加剂尚未见报道,但它在降低β-葡聚糖黏度方面很有潜力,因此有望成为新型饲料添加剂。本论文主要研究地衣芽孢杆菌2004β-甘露聚糖酶的纯化、酶学性质、酶基因的克隆和异源表达以及粗糙脉胞菌内切β-1, 3-葡聚糖酶基因的克隆,改造和初步表达。地衣芽孢杆菌2004β-甘露聚糖酶经硫酸铵沉淀,DEAE纤维素离子交换和superdex-75分子凝胶过滤等方法将衣芽孢杆菌2004β-甘露聚糖酶纯化到电泳及纯度,酶比活达到2826.4 u/mg,纯化了16.17倍,收率为10.56%。纯化酶酶学性质分析结果表明,衣芽孢杆菌2004β-甘露聚糖酶的最适反应温度为70-80℃;反应的最适pH为5.8-6.0;pH稳定范围为4.0-9.0。金属离子Al~(3+),Cu~(2+)能强烈抑制该酶活性;而Rb~+、Mn~(2+)、Fe~(2+)和Co~(2+)对该酶略有抑制作用;Na~+和Li~+对该酶基本没有影响;Mg~(2+)和K+对酶略有激活作用。适当浓度的Mg~(2+)不仅对酶有激活作用,还对酶的热失活具有保护作用。该酶对魔芋粉和槐豆胶的Km值分别为2.99 mg ml-1和6.03 mg ml-1;Vmax分别为668.6 mg/min-mg和1173.7 mg/min-mg.该酶水解槐豆胶时,产生大量的寡聚糖,同时也产生少量的甘露糖。采用PCR技术从地衣芽孢杆菌2004中克隆出编码β-甘露聚糖酶成熟肽的DNA序列,大小1011bp,阅读框内编码336个氨基酸,大小38 kDa。将此段序列克隆到表达载体pBL-WZX中并在大肠杆菌中成功得到表达。重组大肠杆菌培养48 h内,检测到最高总酶活325 u/ml,是原菌株在最佳培养条件下酶活7倍多。氨基酸序列分析表明该酶是糖苷蛋白家族26中一个成员。以粗糙脉胞菌染色体为模板,PCR扩增出含有两个内含子的内切β-1, 3-葡聚糖酶基因片断,采用拼接PCR方法成功去除内含子得到可在原核宿主中表达的编码内切β-1, 3-葡聚糖酶成熟肽的基因片断,将此片段插入表达载体pET28a,转入大肠杆菌BL21中,在T7启动子的控制下进行表达,经IPTG诱导表达后,在SDS-page上检测到大约80 kDa的蛋白条带。……   
[关键词]:β-甘露聚糖酶;内切β-1;3-葡聚糖酶;纯化;酶学性质;基因克隆;异源表达
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:江南大学2005年
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