手机知网 App
24小时专家级知识服务
打 开
手机知网|搜索

大豆脂肪氧化同工酶(Lox1)单克隆抗体的制备及其检测应用

刘渊

  大豆种子中存在约占总蛋白含量1%的脂肪氧化酶(Lipoxygenase,简称Lox),包含3种同工酶Lox1、Lox2、Lox3,通过催化不饱和脂肪酸氧化,产生共轭的过氧化氢物,可直接与食品中的蛋白和其他营养成分结合,降低豆制品的食用性和营养价值,最后生成醛、酮、醇等有异味的小分子挥发性物质,使豆油及豆制品产生豆腥味,苦涩及青气味。大豆脂肪氧化酶成为限制大豆营养价值和食品风味的主要抗营养因子。近年来,科技工作者就脱腥问题进行了多方面的研究,在加工工艺不理想的情况下,采用回交转育的方法进行遗传改良,利用快捷、灵敏、有效的检测手段筛选缺失脂氧酶的后代,建立缺失品种的近等基因系,将是去除豆腥味和改善大豆营养品质的有效途径。研究表明大豆脂肪氧化酶是球形的水溶性蛋白质,分子量为94~97KD,符合免疫学研究的要求,可作为完全抗原进行免疫。为此,本实验制备大豆脂肪氧化同工酶(Lox1)的单克隆抗体,并建立了Lox1的检测方法。利用薄板等电聚焦凝胶电泳(IEF-PAGE)鉴定大豆脂肪氧化酶的缺失近等基因系材料,Lox2缺失的情况下,Lox1向pH偏小的方向迁移;Lox1缺失,该酶带消失;Lox3缺失,Lox3a存在,Lox3b蛋白带消失。检测后不同缺失类型的子粒分装保存。并设计通过非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳(Native PAGE)进行分离,调整分离胶浓度为10%,浓缩胶的浓度为5%,经过分析不同缺失类型,推断出代表大豆脂肪氧化酶同工酶Lox1、Lox2、Lox3的特异性蛋白条带。本文通过电泳洗脱仪回收三种大豆脂肪氧化同工酶的蛋白条带,考虑到纯化后Lox1的纯度及其酶活均远大于Lox2、Lox3,并且适当减少后期繁重的工作量,仅以Lox1作为免疫抗原。采用紫外分光光度法测定其浓度:①0.1896mg/ml②0.7607mg/ml③0.0769mg/ml,其酶活为76.668%。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定该酶蛋白的分子量约为94 000 dal左右。以Lox1作为完全抗原,采取皮下多点注射,并参照适当的程序设计免疫方案,强化其免疫应答反应,经过间接ELISA测定免疫血清效价为1:1600。同时用完全DMEM培养液孵育骨髓瘤细胞达到对数生长期,可将已免疫BALB/C小鼠的脾细胞和SP_2/O鼠骨髓瘤细胞进行融合,建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞的阳性克隆,通过有限稀释法,获得9株能稳定传代且分泌抗大豆脂肪氧化酶Lox1单克隆抗体的杂交瘤细胞,各株单抗的效价均在1:64以上。仍然采用间接ELISA测定Lox1的方法,验证3株单抗与其他脂肪氧化酶类型没有交叉反应。通过对其特异性的鉴定,确立了产生大豆脂肪氧化酶Lox1高度特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,进而利用间接酶联免疫技术进行Lox1缺失与否的鉴定。以期为今后制备Lox2、Lox3的单克隆抗体提供实验技术基础;为种质资源的创新,食品加工的工艺改良以及辅助遗传育种提供投资少、见效快的鉴定方法;也为进一步研究大豆脂肪氧化酶同工酶的蛋白作用机制提供新的研究方向。……   
[关键词]:大豆;脂肪氧化酶;单克隆抗体;ELISA;检测
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:河北农业大学2005年