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DCN原核表达体系的构建及其对胃癌细胞株BGC-823的影响

王艳红

  核心蛋白聚糖(decorin,DCN)是一种小分子富含亮氨酸的硫酸皮肤素蛋白聚糖,广泛存在于正常细胞外基质中,其核心蛋白具有抑制细胞增殖、影响细胞外基质形成等多种生物学作用。DCN 基因外显子序列长1080bp,编码395 个氨基酸。目的通过克隆hDCN 基因,构建原核表达体系并表达DCN 蛋白,进一步研究其对胃癌细胞株BGC-823 的抗增殖作用以及对细胞突变P53、血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的影响。方法首先利用DCN 特异引物,通过RT-PCR 方法从人肌肉组织中扩增编码DCN 分子的外显子序列,与pET-21a(+)载体连接,构建原核表达体系pET-21a(+)-DCN 的重组质粒。经双酶切、测序鉴定基因序列,然后将鉴定正确的重组质粒转入表达工程菌E.coli BL21(DE3)中,用IPTG 37℃诱导获得DCN 融合蛋白。SDS-PAGE 凝胶电泳分离、洗脱、透析纯化后,得到纯化的融合蛋白。在胃癌细胞株BGC-823 培养液中加入不同浓度的DCN,作用一定时间后,用活细胞计数、MTT 法测定DCN 对BGC-823细胞生长的抑制作用,通过倒置显微镜、HE 染色观察细胞的形态学变化。利用免疫细胞化学染色法检测胃癌细胞中突变P53、VEGF 在处理前后的变化。结果本研究克隆了hDCN 基因,成功构建了pET-21a(+)-DCN 重组质粒。重组质粒双酶切以及测序结果均证明克隆的DCN 基因完全正确,获得了稳定表达pET-21a(+)-DCN 的原核表达体系,并得到了纯化的融合蛋白。用DCN 对胃癌细胞株BGC-823 进行干预的结果表明,DCN 在5~30μg/ml 对胃癌细胞BGC-823 均有抑制作用,并表现出浓度依赖性关系,各剂量组间均有显著性差异(P<0.05),且随着作用时间延长生长抑制率也增加(P<0.05)。在倒置显微镜下及HE 染色后可以看到处理组细胞体积缩小、变圆、细胞突起回缩,细胞核浓缩、有凋亡小体形成。免疫细胞化学结果表明突变P53、VEGF 在处理组中的表达显著低于未处理的对照组,而且作用呈现时间和剂量效应(P<0.05,P<0.01)。结论本课题制备了pET-21a(+)-DCN 稳定的原核表达体系,表达并纯化了DCN,进一步研究了其生物学活性。DCN 有诱导胃癌细胞凋亡和抗增殖的作用,并能下调胃癌细胞中突变P53 和VEGF 的表达,这种作用可能与其抗增殖、抑制肿瘤细胞浸润有关。……   
[关键词]:核心蛋白聚糖;原核表达载体;胃癌细胞;抗增殖作用;突变P53;VEGF
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:山西医科大学2005年