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疏绵状嗜热丝孢菌热稳定几丁质酶纯化及其编码基因的克隆与表达

郭润芳

  几丁质酶因其在各个领域潜在的应用价值而倍受关注,它除了被用于植物病原真菌和害虫的生物防治;可以用作外敷药物治疗由真菌引起的人类疾病;可以制备酵母和丝状真菌的原生质体,进行菌株改良。近年来,几丁质酶还用于几丁质的生物转化。几丁质经几丁质酶部分水解后产生生物活性物质几丁寡糖,被广泛应用在农业、医药、化工、食品、环境等许多领域。但采用化学方法控制几丁质降解,难度大,成本高,对环境污染严重。采用生物降解不仅有效的克服了这些问题,而且可以提高资源利用,增加经济效益。国内外已筛选出多种几丁质酶生产菌,并将其分离提纯。但市场应用的几丁质酶主要来源于常温菌,因产品成本高,热稳定性差,货架寿命短, 酶活力和产率低而制约几丁质酶在农业、工业上的应用。由此可见,热稳定性几丁质酶的研究和开发具有重要的商业价值。尽管已经分离了许多种几丁质酶,相关的基因也已克隆和表达,但有关热稳定性几丁质酶的研究却很少。目前仅从极端耐热古细菌Thermococcus chitonophagus、Thermococcus kodakaraensis KOD1、以及细菌Bacillus BG-11、、Streptomyces OPC520、等中分离到对热稳定的几丁质酶,而来源于嗜热真菌的热稳定几丁质酶还未见报道。疏绵状嗜热丝孢菌(Thermomyces lanuginosus)是一种广泛分布的,生长上限温度较高的一种嗜热真菌,从该菌中已分离了多种嗜热酶,但未见嗜热几丁质酶的报道。本研究中Thermomyces lanuginosus 在以胶状几丁质为唯一碳源的合成培养基中诱导产生了胞外几丁质酶,通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow 阴离子层析、Phenyl-Sepharose 疏水层析等步骤获得了凝胶电泳均一的几丁质酶。SDS-PAGE 测得所分离纯化酶蛋白的分子量约为48kDa。该酶的最适反应温度和pH 分别为55℃和4.5。在pH4.5 条件下,该酶在50℃以下稳定,65℃的半衰期为25min;70℃保温20min 后,仍保留24%的酶活性。Ca~(2+) 、Na~+、K~+、Ba~(2+)对酶有激活作用,一些重金属离子Ag~+、Hg~(2+)对酶有显著的抑制作用。而且该酶对齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)和小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)的菌丝生长,……   
[关键词]:疏绵状嗜热丝孢菌;热稳定几丁质酶;纯化;cDNA 克隆;表达
[文献类型]:博士论文
[文献出处]:山东农业大学2005年
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