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重复多色荧光原位杂交技术的建立及其在食管癌中的应用

杨壹羚

  目的:染色体畸变包括数目和结构改变,是肿瘤发生的重要事件。由于技术原因,迄今报道食管癌染色体畸变的资料很少。本研究旨在建立重复多色荧光原位杂交技术(Repetitive multicolourfluorescence in situ hybridization,RM-FISH)及原发性食管癌染色体直接制备方法,并以食管癌细胞系RM-FISH分析为出发点,对食管癌染色体畸变进行初步探讨。同时,为食管癌及其它实体肿瘤的染色体研究提供新的技术平台。方法:采用六色荧光原位杂交技术与重复杂交策略相结合的方法,建立重复多色荧光原位杂交技术:该技术将24条特异性的染色体(22条常染色体和2条性染色体)涂染探针,分别用Cy3、Cy5、FITC三种荧光素直接标记,组合制备四组六色的探针池,对同一染色体片先后进行四次杂交,探针及4,6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)信号通过装备了相应滤镜及CCD相机的荧光显微镜捕获,图像的摄取及转化为数字格式存储的过程应用Metamorph Imaging System软件;运用RM-FISH技术对三个食管癌细胞系KYSE410-4、KYSE410-1、EC9706进行全染色体组畸变分析,根据ISCN1995标准鉴定核型及一致性的改变;同时以15例手术切除的食管癌新鲜组织为材料,建立原发性食管癌染色体直接制备的方法。结果:1) 在常规FISH技术的基础上建立了重复多色荧光原位杂交方法。2) 对食管鳞癌细胞系KYSE 410-4、KYSE 410-1及EC9706进行了RM-FISH分析,结合反相DAPI显带完成了核型的鉴定,发现了众多染色体畸变。这些异常包括缺失、易位、插入和标记染色体等,平均每个细胞系有26.7处改变.发生改变最多的染色体是1号、5号和11号;在三个细胞系中均检测到3号染色体短臂缺失和长臂增益及Y染色体的丢失;在KYSE 410-4和-1中发现了3号染色体长臂的等臂现象;在所有检测到的48个易位中,5号和9号染色体发生频率(10/48)最高,另外还检测出1号、3号和5号着丝粒的染色体易位。3) 建立了原发性食管癌染色体直接制备的方法,成功率达26%,并完成了一例组织染色体的FISH核型鉴定,结果是46,XY。结论:1) 本研究建立的重复多色荧光原位杂交技术简便、易行,能够用于全染色体组型分析,尤其是染色体隐匿性重排及复杂核型的鉴定。2) 以食管癌细胞系的核型分析为出发点,所发现的5号和9号染色体易位、3号染色体长臂的等臂染色体形成、整臂染色体易位及Y染色体丢失,对于进一步了解食管癌并揭示其发生、发展规律提供了信息。3) RM-FISH技术与原发性食管癌染色体直接制备方法的联合,为食管癌和其它实体肿瘤的染色体畸变及其发生、发展机制的研究提供了新的技术平台。……   
[关键词]:染色体畸变;荧光原位杂交;核型;原代培养;食管癌
[文献类型]:硕士论文
[文献出处]:石河子大学2005年