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丰香草莓高效再生的机理及遗传转化研究

秦永华

  草莓是重要的水果之一,在世界各地广泛分布。草莓栽培中存在不少问题,如耐寒、抗虫、抗病、抗病毒等优良品种缺乏,严重制约了草莓生产的发展。过去常规杂交育种在提高草莓品种的产量、品质等方面取得了一定进展,但草莓多为八倍体,遗传上高度杂合,给杂交育种带来很大困难,而且常规育种周期长,费时费力,给育种工作者带来了难度,因此需引进新的手段和方法进行育种。现代生物技术的飞速发展为草莓育种提供了新途径,它可以获得常规育种难以得到的新类型,从而创造出新种质。现代生物技术在植物育种中的应用是随植物组织培养技术的发展而兴起的。由于农杆菌介导的遗传转化主要依赖于受体材料的再生能力及农杆菌的转化效率,因此建立高效的受体再生体系是遗传转化成功的关键。本试验以草莓主栽品种丰香为试材,研究了再生过程中激素配比、有色膜、AgNO_3、暗培养、抗生素等因素对草莓离体再生的影响,探讨了不同有色膜下丰香草莓再生差异的原因和AgNO_3对草莓生长的影响及其机理,为建立高效、可重复的再生体系奠定理论基础。在分别构建ADP和INS基因植物表达载体基础上,通过根癌农杆菌介导分别将APD和INS基因导入草莓基因组,对影响农杆菌转化频率的各种主要因素进行筛选,得到一个最佳的转化体系,获得了转化植株。Kan筛选、PCR检测和Southern杂交检测证明目的ADP基因已经整合到草莓基因组中。对INS基因抗性愈伤组织PCR检测表明,INS基因已整合到草莓基因组中。主要研究结果如下:(一) 草莓高效离体再生体系的建立(1) 不同激素组合对丰香草莓不定芽再生能力的研究表明:TDZ单独使用可以诱导出不定芽,随着TDZ浓度的增加,不定芽再生率逐渐提高,但诱导出的不定芽玻璃化现象也随之加剧。因此,TDZ不宜过高,以1.5mg.L~(-1)为宜。TDZ 1.5mg.L~(-1)与IBA配合使用,可显著提高丰香不定芽的再生率,当IBA的浓度为0.4mg.L~(-1)时不定芽再生率最高(76.7%)。2,4-D不利于芽的分化,随着2,4-D浓度的提高,不定芽再生率逐渐降低,诱导出的愈伤组织由浅黄色逐渐变为灰白色,并且褐化加剧。(2) 重金属元素Ag~+对丰香草莓不定芽再生能力的影响表明:草莓外植体在MS+1.5mg.L~(-1)TDZ+0.4mg.L~(-1)IBA分化培养基附加1.0mg.L~(-1)AgNO_3的中预培养10 d后转入不含Ag~+的分化培养基中培养,不定芽再生率(87.38%)和每个外植体再生的芽数(11.67)有显著提高,且始分化期可以提前5-7 d。(3) 不同有色膜对丰香不定芽再生的影响很大,培养45 d后,不同有色膜条件下不定芽再生率以红膜和绿膜为最好,分别为100%和98.28%,其次为荧光(75.81%)、蓝膜……